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FDA指导文件

证明人用生物制品可比性指南

（含治疗用生物技术制品）

（FDA CBER， CDER， 1996．4）

    1．前言：

  本指南系FDA目前所致力改革内容的一部分，其目的在于为生产厂家提供更多的灵活性，以便使重要的优质人用生物制品更有效、快捷地投放市场。本指南阐述了产品可比性的概念，描述了FDA关于产品可比性的现行规范，这些产品包括CBER管理的人用生物制品、治疗用生物技术产品，CDER管理的治疗用生物技术产品。指南叙述了生产厂家应采取的措施，经FDA评估，生产厂家无需因生产改变另外进行临床试验证明产品安全性及有效性。

同其他指导性文件一样，FDA不准备在本指南中包括所有内容，其目的在于提供信息，而不是制定规程。生产厂家可遵循本指南提出的程序，亦可选择本指南以外的其他程序，在采用其他程序前，生产厂家应就此事与FDA讨论，以免后期因FDA未批准而造成资源损失。

本指南将不对任何个人产生或授予任何权利，本指南的实施对FDA或公众均不产生任何约束力，然而，本指南体现了FDA关于证明产品可比性的意向。当本指南所重申的某一要求系法令或法规的内容时，其法律效力和作用将不受本指南结论的任何影响。

Ⅱ．背景

长期以来，生物制品一直是难以作为单一物体鉴定的各种分子形式的复杂混合物，在某些情况下，人们难以确定其特异活性部分，或者，活性部分存在于其他成分的周围，这些成分对他的许多特性具有潜在影响。在另一些情况下，原料具有潜在的传播传染因子的可能性。由于鉴定同一性、结构和测定临床有效成分活性的能力有限，生物产品通常按生产过程进行界定。生物制品的生产工艺包括生产方法，设备及设施，这就是为什么生物制品需申请生产企业许可证（ELA）的原因。FDA注意到，生产过程、设备或设施的改变可导致生物制品自身的改变，并且，有时需要补充进行临床试验，以证实产品的安全性、同一性、纯度和效力。

对生产方法、生产和质控方法以及产品检定方法的改进能导致生物制品管理的进步。例如，在FDA批准某一生物制品生产厂家的产品之前，但在关键性临床试验之后，该厂家着手改进其生产工艺可不必补充进行临床试验，证明其产品的安全性、纯度和效力仍符合要求。发起人可以通过不同类型的分析和功能性试验，在进行或不进行临床前动物试验的情况下，证明生产工艺改变前后产品的可比性。如果可比性试验结果证明生产工艺的改变不影响产品的安全性、同一性、纯度和效力，FDA可做出两种制品具有可比性的决定。

FDA注意到，生产厂家可能因各种原因，寻求改进某特定产品的生产工艺，包括提高产品质量，收率和生产效率等，FDA根据具体情况审查对生产工艺提出的改进，以确定证明产品可比性所必需的资料，包括临床资料。FDA的评估部分是根据改变生产的类型和所涉及生物制品的类别。FDA在1990年制定的《关键性临床试验前细胞因子和生长因子的资料包》中指出：在关键性的临床试验和提交产品许可证申请时期之间，如生产工艺改变较大，则有必要补充进行验证、动物和体外试验，以及／或临床试验。FDA在1994年制定的《人用单抗产品生产和检定考虑要点》中，包括了题为“改变生产的有关问题（证明产品相当性product equivalence）”的章节，FDA在本文对临床开发期间生产变化的讨论中注意到这种变化的经常性。FDA指出证明产品相当性可能不需要扩大临床资料，这取决于体外试验、动物试验的类型及资料的质量，生产厂家应记录在产品开发过程中对生产进行的所有改进，如此生产工艺和对生产的改进或许能在关键的临床试验中得到验证，并确定上市产品与早期临床试验产品的关系。

在过去，FDA在可比性资料能够继续保证产品安全、纯度及效力（有效性）的情况下，曾批准了在临床研究过程中和结束后对生产进行的改进。在产生于产品被批准前后对生产工艺进行的更改，包括从中试到全规模生产的变化，生产设施从一个法律实体迁移到另一个实体，以及生产过程中不同阶段的改动，例如发酵、纯化和配制。在所有情况下，FDA的评审员以他们集体的科学和管理经验，做出与相应的法律体系和当前认识相一致的最佳评价。

对于产品批准前生产的改变，FDA认为：非临床实验室资料，以及为证明产品符合21CFR 601．2（a）章中所述的安全、纯度及效力标准所进行的临床试验资料，应包括生产改变前原产品的临床资料，这样，生产厂家可论证原产品与现产品具有可比性。因此，生产厂家可以证明生产改变前后产品的可比性。如果 FDA认为生产厂家有能力证明可比性，FDA可批准厂家实施这一改变，并不需补充进行临床试验。

FDA注意到，生产方法、工艺、质检方法和产品特性的检定方法的改进，使生产厂家有机会鉴别和评估生产工艺和设施变化所产生的影响。例如，近年来，分离大分子、产品和有关工艺的技术大大提高，生产厂家有能力建立灵敏度高经过验证的鉴别产品和生物活性的方法，也有能力对试验中发现的重大差异做出评价，这种能力为FDA在不重复进行临床有效性试验的情况下评定产品可比性奠定了基础。

FDA已审查了现行的指导文件，以便澄清本指南与现行文件的潜在的分歧点。FDA并未发现本指南与原文件有不一致之处。然而，如生产厂家或其他人对先前指南的解释在某种程度上与现文件不一致，那个指南已被取代。如果在某种程度上，厂家发现或认为原指南关于生产变化问题的说明不明确，DDA现在明确指出：本文件中阐述的和 FDA当前采用的可比性指南是FDA对此类产品的现行政策。参见（1983年）干扰素检测程序：人用研究性干扰素的生产和检测的考虑要点；（1990年）关键性临床试验前细胞因子资料包（包括生产厂家应采用批准后相同的生产工艺生产用于关键性临床试验的产品的参考材料）；以及（1995年）FDA关于利用中试设施开发生产生物制品的指南（中试生产的某些方面应与商品化规模生产相一致的参考资料）。

Ⅲ 产品可比性试验

本指南强调了产品批准前后改变生产的可比性试验。对于现行的适用的法律和法规项下的产品批准前的生产变化，生产厂家必须在任何许可证或试验用新药申请中详细阐述该变化。FDA敦促厂家在实施可能影响可比性试验的改变前，向FDA咨询，以免延误对申请的审查。

生产的改变可能导致某一产品观察不到的变化。换言之，在以前无资料证明其影响的情况下，产品一种或多种特性有小的改变，对产品的药理可能无任何影响，也可能产生显著影响；同样，在以前无资料证明其影响的情况下，产品的一种或多种特性有大的改变，对产品的药理可能不产生或产生显著作用。FDA评价产品可比性最重要的因素是对这些生产改变能否成为影响临床安全或有效性的重要因素做出预测。

生产厂家应详细评价生产的改变，对改变后生产的产品与改变前的产品的可比性进行估价。化学、物理、生物学试验以及某种情况下所需的其他非临床资料，应作为确定产品可比性的依据。如果发起人能够证明可比性，那么就不需补充进行新产品的安全性／或有效性临床试验。FDA将对可比性资料是否足以证明不需补充进行临床试验做出决定。

对产品生产所涉及生产工艺的了解，是确定一个适宜的可比性评定计划的重要内容。在确定所需试验类型中，FDA可考虑生产变化的范围以及发生变化的生产阶段。可比性试验计划可包括：分析试验、生物试验（体内或外）、药物动力学和／或药效学及动物毒性评估以及临床试验（临床药理学、安全性、有效性）与从分析动物到人类药物动力学、药效学及临床安全性、有效性试验相结合。然而，可比性试验不是一个简单的由一种特定试验的结果决定下一级试验的分层系统。事实上，有时所进行的许多实验是互相补充的。例如，药物动力学分析通常能反映出其他类型试验（体外试验）所不能反映的生物学现象。

生产厂家应向FDA提供对老产品和合格的新产品进行化学、物理及生物活性并列对比分析的详细资料。在可能的情况下，应采用经全面鉴定的参比标准和成品容器原料。除为充分评估生产改变对产品影响所进行的检定试验外，还应进行签发半成品和成品前的常规检定。补加的检定内容通常包括最可能受生产改变影响工序的中间品检定。生产厂家可进行以下试验：

    A分析试验：

分析试验包括化学和物理两种检测，所选择的试验方法应能灵敏地检测出由于生产工艺改变可能引起差异的全范围。分析试验的敏感性和幅度是决定补加试验的性质和程度的重要因素。这些试验应包括对所有生产批的常规检定，还应包括为充分鉴定产品结构、同一性，并证明产品批连续稳定性所进行的试验，以及适宜的新试验。

    B．生物试验

生物试验是发起人为评定产品活性／效力所进行的功能性试验，这些试验还可用于衡量产品的生物学完整性（如结构正确）并补充其他分析方法。发起人应对这些试验进行验证并规定产品活性合格的特定范围。试验可包括适当的体外试验（即：细胞生长、酶活性、抗病毒试验、感染性试验），或用相关动物进行体内试验：如产品在体内的作用机理是已知的，则生物试验（可能时）应反映该活性。应考虑到以体内和/或体外动物模型预测对人体的生物学效应。例如疫苗，发起人应评估所进行的试验（如评估免疫原性）与临床保护的相关程度，并将资料报FDA，以便决定在生产改变后是否应进行临床试验。如果某一产品具有多种不完全相关的活性或其临床作用机理未知时，生产厂家有必要考虑进行一项以上功能试验。当药物有一种以上剂型，且生产的变动改变了销售的剂型时，测定各种剂型的生物活性对于估价生产改变造成的影响可能有意义。

分析试验和功能试验的综合检测精确度和性能对评估产品的主要特性是至关重要的。发起人和FDA均应对两种试验模式的结果进行评估，以确定需补加试验的范围。

      C．临床前动物试验

      在可比性评估中，除各种体外试验外可用动物进行体内试验，以确定药物动力学参数、药效活性以及毒性终点。既使在产品的分析试验或功能试验未显示出差异的情况下，可能仍需要用动物的药物动力学资料进行可比性评估。这是由于分析试验可能对影响药物动力学的变化不敏感，并且体外功能试验可能不反映随时间变化的分布。由于药物动力学差异产生的活体内暴露差异可能导致治疗活性的不同。因此，药物动力学的评估通常被认为是对功能性试验的补充。然而对于激素来说，体内效力试验通常需考虑动物的潜在的药物动力学及药效分布因素。一旦这类激素制品的生物利用率出现疑问时，可能需要用临床药学研究证明其可比性。

充分的药物动力学测定可包括平行或交叉研究方式，对Cmax，Tmax，AUC和t进行测定，在出现对异种蛋白免疫应答引起并发症的情况下，交叉设计可能是不适宜的。在另一情况下，发起人应考虑与结合蛋白及内源蛋白的水平有关的引起并发症因素。在动物试验不相关的情况下，有必要进行临床药理学试验以证明可比性。

在产品批准前，生产厂家一般不必要为证明产品的可比性而重复进行对原生产工艺产品做过的全部毒理学试验。在某些情况下，若免疫原性是安全性的主要问题，仅需进行补加的动物试验。补加的毒性试验的必要性和范围可取决于原产品的安全性情况、生产工艺变化及对产品影响的大小。如产品的治疗范围很窄，或存在特定的不安全因素，如因生产工艺的改变而出现分析试验检测不到的毒性杂质或外源因子，可能需进行补加试验。

D 临床试验

临床试验包括人药理学试验、免疫原性、安全性及/或效力试验。虽然可比性试验可包括某些形式的临床效力试验，但通常可比性试验不包括效力试验，FDA可根据这类可比性资料，决定是否有必要进行补加的临床效力试验。从总体上讲，有必要进行人体的药理学试验，以评估生产改变可能对产品药物动力学或药效学（即：产品配方的改变）的影响。

一旦生产工艺的改变引起产品结构和/或生物活性的差异，并/或导致药物动力学模式的改变，而这些差异能潜在影响产品安全性、纯度、或效力，在这种情况下，一般可能需要进行补加的临床试验，以评估产品的安全性和效力。除此之外，如分析试验和其他临床前试验的灵敏度及广度不足以检测出此类差异时，则有必要进行补加的临床试验。

    E．补充考虑

就可比性试验而论，如果半成品药物的生产工艺发生变化，生产厂家一般应进行深入的分析试验，并辅之以功能试验。此类变化包括：生产厂地的变迁；细胞或菌毒种的改变，包括主细胞库的变更；发酵及分离或提纯中的变化。在某些情况下。还需要补充药理学资料或生物应答资料（如：疫苗的抗体滴度）。

关于成品的变化，例如贮存容器的改变、剂型（如：由溶液改为重溶冻干粉｝或分装场地的变迁，则需要提供签发成品标准规格的对比资料及产品稳定性资料。但是，如成品的配制发生改变时，需进行比较药物动力学试验或其他类型的试验。

由于任一生产工艺的改变及任一种产品均牵连着产品的安全性、同一性、纯度及效力问题，因此，生产厂家应在制定可比性试验计划时，考虑到生产工艺改变的类别、产品开发的阶段及临床特征（如：患者人群，临床终点、用药途径，剂量反应曲线的斜率、疗程及持续时间）。中间品和成品检定的重点应集中在受到工艺改变影响的工序。生产厂家应对改进的生产工艺进行验证，并提供产品批的认证资料。适宜的工艺验证标准应随着工艺改变性质的不同而异。生产厂家是否有能力利用经验证的灵敏的检验方法，证明产品的同一性、结构、生物学活性及临床药理，为确定是否不重复临床效力试验证明产品的可比性奠定了基础。

IV．产品可比性文件

此可比性文件描述了可由许可证申请者、已获许可证人员、研究用新药发起人采纳的试验，描述了 FDA为决定证明产品安全性、纯度、效力／有效性的必要的资料种类应进行的试验。

FDA应决定必要的不同类型的可比性试验的范围，例如：在某些情况下，FDA可决定无需进行临床试验。又如，FDA可根据可比性资料，决定有必要进行临床效力试验。

为提高对申报产品的复查和审批效率，FDA鼓励产品的申请者及研究用新药的发起人在实施改变生产工艺前和产品批准前，就改变事宜向FDA咨询。申请者可向FDA提供以下资料：生产改变的描述，所进行的相应的可比性试验研究，可比性试验资料，许可证／新药申请的证明文件，研究用新药或许可证/新药申请的修订，及研究用新药的效果。对于生物制品而言， FDA要求申请者应依照21CFR 601．12或21CFR 314．7（g）章节中的规定及FDA有关应报告的改变的指南提交生产改变资料。

在21CFR 601，12一章中，描述了申请者应向FDA报告的改变的内容，以及在产品批准前需报告的改变，FDA拟建议修订此规定。生产广家应在决定提交报告时，参考现行的规定以及任何适宜的指南。

在各种情况下，均应准备好适当的材料，以便使FDA的评审员和调查员对改变的类型、改变所处的生产阶段及涉及的产品有所了解。这种资料包括非临床及临床试验的有效证明文件，不同的产品及改变所处的不同生产阶段的证明文件应不同。

V，结论

如果提交FDA的可比性资料可证明产品在生产工艺改变后的安全性、纯度及效力/有效性，FDA可决定该生物制品（包括规定为生物制品或药品的治疗用生物技术产品）生产厂家可以执行生产工艺的改变，并且无需进行补加的临床效力试验。

 

 

 

 

 

 

血液制品生产设施的质量保证

（FDA，1995，7）

目的

  本指南旨在协助血液及血液成分生产设施（包括血库、输血站及血浆单采中心〕在与公认的质量保证原则及现行药品生产质量管理规范（CGMP）相符的前提下制订质量保证（QA）体系。

范围

  本指南提供的有关程序和规范的一般信息可能对血液机构制订及执行质量保证体系有帮助。由于药品、食品管理局正在修订21CFR10·90（b）文件，本文件末在21CFR10·90（b）授权下颁布，本文件尽管被称作指南，但并不具有强制性以及不提供或授予任何权力、特权，也不受益于任何人。血液机构可以遵照本指南，也可以使用本纲要求提供的其它程序，血液制品生产设施可以与管理机构深入探讨该问题，以防止在药品食品管理局不能接受的活动上浪费资源。

  用于预防、治疗、处置人类疾病或创伤的血液及血液成分属于公共卫生法351项下（42U.S·C·262）管理的生物制品。同样，意在用于诊断、治疗、缓解、处置或预防人类疾病的血液及血液成分分属于联邦食品、药品及化妆品（FD＆C）法（21．U．S．C321（g）］201（g）项下定义的药品范畴。根据联邦食品、药品及化妆品法501（a）（2）（B）项下陈述，如果“制造商在加工、包装及贮存过程中所使用的设施、方法或控制标准其操作及管理过程与保证该药品符合FD＆C法要求所制订的现行药品生产质量管理规范相悖时”则该药品应定为假冒药品。因为血液及血液成分在FD＆C法中属药品。现行药品生产质量管理规范中21CFR项下的210及211部分均适用于它。此外，FDA在21CFR项下606部分内还颁布了适用于血液及血液成分的CGMP规定。

  本指南意图将21CFR项下 600至680，210至211部分与适用的联邦标准结合一起。210.2项下要求 210至 226，600至680部分的规程应当视为补充，不可互为替代。当不能遵守210至226，600至680应用规程时，则特别适用于该药品的法规应当被采用并替代通则。有关21CFR项下互为补充的210至211， 600至680部分的例证见附录A，本指南视需要而定期修改。血液制品生产机构应当认识到在1988年的临床实验室改良修正案下（CCLA），凡是进行实验检测的血液机构包括血库、输血站、血浆单采中心还必须遵守 42CFR项下493部分的应用规程，这些规程自 1992年9月1日起正式生效，它确定了实验人员、质量控制、资格审核，病人检测管理以及建立在实验复杂性和病人危险因素基础上的质量保证等项标准。

      前言

一般来讲，美国是世界上最安全的血液供应国家之一，这主要由于对献血员及血液制品质量制订并执行了相应标准。自1983年起，进行了包括执行新的检验及合格献血员指标在内的许多重要改进。此外，FDA加强了对血液机构的监督并将因标准有缺陷而引起的不合格血液或血液成分的分发记录存档。这些发现可能与几种因素有关（1）试验检查的项目增多（包括复杂的试验检查增加了出现差错的机会）（2）使用了包括计算机系统在内的复杂先进技术及仪器（3）缺乏受过适当培训的卫生保健及试验室工作人员（4）血液机构需要更加尖端的加工及系统控制程序，包括培训及监督现有人员的程序。

在1988年4月6目的备忘录中， FDA的生物制品评价及研究中心（CBER）要求血液机构审核工艺流程及人员培训计划，以确定安全的程度，从而防止不合格血液制品的发放。 CBER 3月20目的备忘录中已经提醒血液机构，由于在加工过程中的差错及事故而引起了对产品质量的大量投诉，CBER对于引起不合格制品流入市场的差错及事故的典型事例已做了描述。此外，CBER还要求血液机构必须上报差错及事故，并追踪调查。

为确定国家血液供应的连续安全性，血液机构对生产工艺及系统必须执行有效的质量控制。FDA认为每一个血液机构能够建立旨在识别及预防本机构在运作过程中再度出现缺陷而设计的包括计划周密，文档详细及严格管理在内的质量保证体系。质量保证（QA）的目标就是要显著的降低差错，保证试验结果的可信性；执行有效的生产工艺及系统质量控制，确保产品的安全及质量有连续性。QA包括预防、检测、调查、审评以及校正差错的种种措施，重点是防止差错而不是事后检查差错。

执行质量保证体系需要投入时间及资源，质量保证体系的设计及范围取决于血液机构的大小及所进行加工活动的复杂性，考虑到可能导致潜在的公共卫生后果，因此要求所有血液机构不论大小都必须重视QA的投资。

质量控制及质量保证体系

质量保证体系的设计及实施是为了确保制造过程中生产出具有稳定质量的制品，它是实施计划及一系列活动的总和，用于确保所有体系及其影响产品质量的要素按照预期设想与实际而运作。质量保证体系具有几个方面的含义，它包括质量控制（QC）过程及现行药品生产质量管理规范（CGMP）。适宜的质量控制规定可认为是CGMP的一个组成成分，包括常规的生产线及生产过程中对生产工艺进行的监测。[见21CFR2ll．22（a），211．100（a），606，140（b）］控制生产之QA的其它方面包括一些有关人员、设施、工艺过程、仪器、检测及文档管理活动的标准。

      质量保证任务

        质量控制部门具有确保产品质量符合21CFR 211．22（a）要求的权力及义务，对于制药业执行上述职能的部门通常被称作质控部门。随着过去20年质量保证概念的进展，凡担负监督与产品质量有关的所有活动的职能部门（包括质量控制部门）通常均称作质量保证部门。因此，质量控制这一名词实际上被许多人认为仅限于描述质量保证体系中的那些用于确定本机构及加工中（例如生产线及生产中检测）的精确性操作以及产品分发等有关的举措及控制。不管对执行质量保证职责的人员如何称呼，而质量保证职能必须建立。尽管21CFR210～211，600～680并末使用“质量保证”这一名词，也明确要求应有相应的职能体系控制生产过程以防止发放不合格制品。为进一步说明，本文件使用的“质量保证”(Quality assurance）这一名词是描述那些确保产品质量的全部体系及诸因素按预期要求发挥功能的所有活动（指经过周密计划并严格执行的活动）。履行该职责的人员组成QC／QA部门。“质量控制”及“质量保证”的定义如上所述，或参照附录中的名词解释。QC/QA部门应当协调、监督、促进所有的QA职责，QC／QA部门可以包括一个或多个专门履行QA职能的工作人员。或者还兼负其它职责的人组成（即人员可以是专职或兼职），但是对于兼职者。不应具有对本职工作的最终监督权［见21 CFR606， 100（c）］， 211， 194］；在小机构中。由一人担负QC／QA职能是允许的，该人员担负控制及审核产品结果的职能，以确保产品符合相应标准的要求。

        上报职责

        QC／QA部门应当向其上级主管或指定领导汇报，在获得许可证的厂家中，该部门应向负责人汇报，该负责人是指代表机构与CBER(参见21CFR600，10）或督管机构直接打交道的领导人。要求领导人或指定的合格人员就各种与遵守FDA要求有关的事务中（包括FD＆C法，PHS法）对本机构实施全面质量控制。必要时，有权实行干预行动，这些人员对所采取的干预行动直接负责，领导人或指定的合格人员还有责任确保人员的合理安排及

培训以完成其职责（见21CFR211，25；600，10 606，201。QC／QA部门对生产到管理作单独汇报，QC／QA部门应确保生产人员遵守CGMP。必要时，QC／QA部门有权制止生产或发出产品。

QC／QA部门的职责

血液机构中 QC／QA部门的职责应包括下述领域但不限于此。

    标准操作细则（SOPs）[见21CFR211，100，606，65（e），606，100］

与SOPs有关的QA职责包括：

(1）确保所有生产程序，包括但不限于检定程序在内都有SOPs。   SOPs应准确描述和界定各个操作程序，包括说明该程序所要达到的目的，SOPs的实际内容可以是生产部门的职责[见联邦注册， 43卷190期，1978年9月29日，第 45O14及 45032页］。

    （ 2）在实施前审查并确保书面批准所有SPOs，确保SOPs与适用的法规与条例要求相一致。此外，每个SOPs实施前，QC／QA部门应确保有下列书面SOP并摆放到位：

                  (a）建立验证方案的程序确保各种方法及工艺达到预期目的；

                  （b)确定完成每一工序的责任者：

    (c）对b项中指明的责任者进行培训并授予上岗证书的办法：

    （d）监督执行所有程序主管人的职责；

    （e）定期进行熟练程度检验的方法；

    （f）定期考评每一程序执行人的方法；

    （g）QA审计过程中考核每一程序完成情况的方法;

    （h)确定某一工序为关键及非关键质控点（见附录名词解释）的工序。

     (i)与文档保管要求相一致的原始记录保管制度；

（3）保存所有 SOPs的索引，存根副本，以及过期 SOPs的档案。

(4）确保对SOPs的内容审校以确定对其它体系或职能的影响。

（5）确保每位雇员持有必需的现行SOPa版本，并能及时按新版本完成既定的职责。

（6）确保验证方案具有前瞻性并认真执行和审核，提出书面验证报告，对于已经采用的生产工艺可根据积累的生产，检定及质控资料进行验证。

（7）确保SOPs的变更和修改有相应的文件记录，包括所修改理由。要确保对变更或更新后的方法及生产工艺进行验证，保证不对本系统或操作过程产生不良影响，对SOPs的修改应按现有的、在实施前经过正式批准的程序进行。

(8)确保有管理QC／QA活动的SOPs，并界定QC／QA部门执行SOP审核、批准或授权的职责，在适当的情况下确保执行审核、批准及授权的职能。

（9）确保有关的SOPs及时更新，以反映生产过程的改变，所有SOPs及生产原始记录至少应每年审核一次。

培训及教育

QC/QA部门应协助制订，审核及确保全体人员培训及教育方案的批准[见21CFR211．25］，培训应包括下列方案

    新雇员训练程序、cGMP培训、SOP培训、技术培训、技术监督培训、行政管理培训、QA培训、计算机化系统培训以及连续教育和连续培训。

    QC/QA应了解那些表明需要培训或再培训的因素。需要上述培训的信息可能来自行政监察、认证检查、任职考核、技术更新、差错/事故报告及投拆意见、QA验证以及血液机构本身整个运转中每个系统关键质控点上发现的问题。

    任职考核

    为确保全体职员受到培训并能胜任指定的任务，QC/QA部门应当执行正规的定期的任职考核计划，应考评下列几项内容的理论及实际知识（但不受此限）;

    （1）直接考查职员在常规及质控过程中的表现，这些内容可包括献血员的筛选、样品处理、检验操作、标示及仪器维护。

    （2）通过审阅工作记录、质控记录、预防性维护记录及其它记录、记载（手工及自动记录两种）来监督实验结果的记录及报告。

    （3）以书面考试形式考查解决问题的技能， SOPs的知识和理论。

    （4）通过采用未知样本及外源提供的资格考核样本来评估职员的业务能力。

    最低录用分数、考核表现及为校正不称职而采取的补救措施都应有文件记载并装入人事档案。考评小结有助于纠正个人或小组的工作问题。

    熟练程度考核

    熟练程度考核通常是检定实验室 QA方案的一部分，QC／QA部门除了对熟练程度考核结果做常规审校外，还应当审核，评价，监察熟练程度考核方案以确保对检验方法、仪器及执行检验的人员进行充分评价。

    对血液机构熟练程度考核过程中应当确保全体人员象常规检验一样使用常规仪器对考核样品进行常规检验。血液机构还应当对备用或替代检查方法如手工检验及“Stat”检验进行考核。检验程序应确保准确，可靠并能快速得到检验结果。

    主管人、行政官长及QC/QA部门应当审核及评价熟练程度考核结果。此外，QC/QA部门还应当对能鉴别特殊问题的趋向及模式的结果进行分析。应当有书面的计划，在熟练程度考核本通过情况下进行补救。

其它质控规定的监察试验室操作方面也可能有用，包括对未知样品及对照结果的统计学分析，初试和复试结果的比较，以及在不同地点用不同方法对同一试验进行比较。

验证

FDA的验证总则指南（1987年5月）提供了验证指导原则，可参照以制定适用于各个机构自身体系或生产过程的验证原则。QC/QA部门应当确保进行充分的验证检查应审查投拆意见，差错停放及关键控制点上的问题，以确定是否需要重新验证或修改验证程序。

设备

设备安装的认证是为了确信工艺设备和辅助系统能在规定的限度及耐力指标内持续正常运转［工艺过程验证总则指南］[1978年5月］。 QC／QA部门应确保按规定执行设备认证，工艺验证，并在维护后进行再验证，以保证所有设备性能正常，应当审核和保存验证检验结果的记录。

设备认证、验证、维护和监控应当有书面程序。此外，应有设备监测、校正、维护的时间安排，以确保其性能符合标准规格要求。设备监测程序应包括对功能异常或无法校正设备的后果进行评价。生产用计算机系统属于21CFR2ll．68 606．60条例管理的仪器。

差错/事故报告、投拆意见及不良反应

QA方案应确保有相应操作程序，并在审核、评价、调查、纠正生产差错及事故中严格执行。另外，还应有确保及时向CBER汇报影响血液制品质量、纯度、安全性的差错和事故的报告系统（见21CFR600，14），QA规则应保证对所有关于产品质量的投拆意见进行调查，以明确该投拆意见是否与生产中的差错或事故有关。调查过程应当包括供审查的依据，以确定投拆是否表现为不良反应，献血员或受血者的副反应有可能威胁生命，造成终身残疾，甚至死亡。各个程序应保证对献血员及受血者的副反应进行全面调查并完全记录备案。根据21CFR606，170 b）条例，死亡事例必项向CBER报告。QC/QA部门应保证对收回的产品及市场撤销的产品按已建立的程序及指南处理。［见 21CFR，第七节］

各个程序应保证对输血反应进行调查，应当有培训护理人员的方案，使他们能识别不良反应的症状并做适当的处置。当怀疑产品污染了细菌时，调查过程应包括复查生产流程，可能为细菌污染时应向采血部门报告。

QA的基本要求就是将通过调查投拆意见、差错／事故及不良反应所获得的知识反馈给QA体系。如果不对投拆意见、差错／事故或不良反应进行调查，就不可能确定并纠正导致问题发牛的因素，生产中的差错或事故可由雇员在常规操作中发现或者由主管人员在复核记录时发现。QC／QA部门应当对生产中出现的差错进行审核。包括那些在产品分发前所发现的差错，QC／QA应当留存差错／事故报告的副本，并保证采取适当的追踪调查行动，应保证落实纠正错误的行动。纠正错误的行动可包括系统或流程上的重新设计，重新培训人员，更改工艺流程。

原始记录管理

QC/QA部门应批准或确保批准所有的原始记录保存系统（手工或自动记录）。电子化或计算机化的原始记录保存系统应经过合理的验证（见21CFR211，68）。 QA程序必须履行以确保所有完成的工作（见21CFR606，16o）有准确完整的记载。审校可以在采血、处理、质量检定以及贮存过程中或之后的恰当阶段进行。

批号的签发程序

如 21CFR606． 3（ C）所界定，由一单位全血制备的各种成分（例如红细胞、血小板、血浆或冷沉淀抗血友病因子）为一批制品，具有相应批号，这个批号通常用采血时确定的单位血液的编号，执行QA以确保对记录的准确性，完整性及是否符合已规定的标准进行审核，签发每批制品前，应当有一人复核与每种成分相关的各个程序的每一重要步骤[见21CFR606，100(c),211,194(a）(7)&(8）]。在此，QA应确保对任何批次间的差异或任何不符合特定要求的批次进行全面调查。

标签的控制程序应与所采用的系统及设备要求相适应。如果自动贴签机出现了错贴现象，需要严格控制程序，以防止此类事情发生见[21CFR211．125］。应当制定并执行书面操作细则，以保证药物使用正确的标签、正确标示及使用正确的包装材料。血液及血液成分在生产过程中的许多阶段都要标示，在采集时产品应标明生产设施预设的产品类型。在后续工艺阶段可以标示产品血型及效期．产品可以由一种类型转为另一种类型（例如，新解冻血浆转为回收血浆，全血转为红细胞）并重新标示，对于由产品转化而需重新标示也应采取同样的控制程序，如同最初标示一样保存标示记录。

在生产过程中，对于需要标示的每道工序都应实行工序控制以确保正确的标示。完成标示的产品在签发前应复核，对于审校最终标示的程序应包括复查相应产品生产记录，并有另外一人复验记录，以确保产品标示无误，内容包括献血员类别、血型、失效期及产品名称。如果遵守了正确的标示控制程序，可以最大限度减少标示错误。

质量保证审计

QA审计是对整个QA系统有效性进行评估的过程，应按照书面程序定期进行综合性审计[见21CFR211，180（e）］，综合性审计审查的原始记录的数量应在统计学上有显著意义，如果已经查出质量问题，或为了更有效地监察某个特别重要的领域则需进行重点审计。但是，仅限于一个领域的孤立审计可能检查不出系统性问题。QC／QA部门重点审计的书面细则应有充分的灵活性，以便在不修改SOPs的前提下进行其它审计。

审计程序的繁简取决于血液机构的大小及待核查的特殊上艺的多少。进行审计的人员应具有丰富的知识，经过培训，有实际经验，能发现待查的特殊工艺问题，审计人员或审计小组不应负责被审计的工艺过程。如果采用外部审计计划，则QC/QA部门应负责保证该审计符合生产厂需要并与21CFR21l，180（e）规定相一致，由21CFR 211，180（e）所要求的年度复查不能作为QA审计。 FDA检查时应提供这些年度复查的记录。应有书的记述审计程序和结果的审计报告。审计程序应包括有关负责人或专职人员及其它负责官员审查和评价审计结果的计划，目的是保证有关负责人了解存在的问题并采取纠正行动，审计报告的保存期限与产品记录要求保存的期限相一致。

审计QA应采取系统性途径。附录B表l～8列出了血液生产作业的主要系统。血液机构作业系统及需要审计的内容至少应包括以下项目：

    质量控制/质量保证

    献血员合格条件

    血液采集

    血液成分制备

    产品检定

    贮存及销售

    签发制品批号

计算机

每个系统可独立或与其它系统联合发挥作用，每个系统的重要控制点是指那些如不能执行或发挥正常作用时，就会影响产品质量及安全性的关键环节。所谓关键环节就是各个重要控制点的各个步骤。QA审计应当评价每个系统的重要控制点及关键因素，重要控制点及有关的关键因素之示例见附录B．表l～8。每个血液机构都应对其自身系统制定相应的审计方案。

附录

附录A， 21CFR 210～211及600～680示例

药品的CGMP对于保证血液及血液制品的质量都是有用的，执行这些规范也是实际可行的，21CFR211部分的CGMP是通则，适用于所有的成品药，也可视需要而更新。这些现范可使制造商有灵活性选择最适合其产品的生产工艺及方法，尽管有此灵活性，制造商自己制定的工艺也必须保证达到CGMP所有的要求。如果厂商确信其变更机制可被接受，则应申请批准使用符合21 CFR640， 120的变更工艺，有少数严谨的工艺可纳入CGMP。“批”（ lot）这一名词用于 21CFR600.3（x）中的牛物制品，这个词在21CFR210.3（b）(10）中也做了规定， 21CFR210．3（b）（2）将“批次”(batch)定义为在一个生产周期中根据一个生产指令而生产出来的在特定范围内具有同样的质量及特征的特定数量的药品或其它材料。为达到GMP的要求。凡用于输血或深加工目的而采集的一单位（a unit）全血或其每种成分既可称之为“lot”也可称之为“batch”，通常可将一单位血液的检验作为同时待检验的许多其它单位血液的一部分进行。当检验（或其它加工）记录中一个记录上出现不止一个单位的结果时，作为整个检验而并非一个批次无需在记录上多次签名。  21CFR21O～226，600～680规范条例互为补充，不可互相替代，除非规范中另有明确说明。当出现不可能遵守21CFR6OO～680 200～211中的所有适用规范时，特别适用于申报药的规范可以代替较一般的规范。下图提供 21CFR211条例及 600～8OO互补条例的示例。21CFR211中的要点，成药的CGMP提供了适用于血液及血液成分的CGMP附加标准。

全血和成分血液GMP

制剂CGMP（包括全血和成分血液）

  生物制品法规描述了对原始记录审查、产品质量控制、实验室控制、仪器设备控制以及质量保证控制的SOPs之内容和要求。但未明确谈及QC／QA部门,CGMP2ll部分明确规定一人或多人将负责 执行QC／QA功能（21CFR 211．22）综合审计记录的审查可由审查有代表性产品的生产记录组成。每件投拆意见、回收产品及废品必须全部审核。   

 

     211．22                                                     

    （a）应设置质量管理部门，该部门有责任和权力批准或拒绝所有的原料、药品容器、密封材料、中间产品、包装材料、标签、说明书和药品，有权审查生产记录，以保证不发生错误如果发生错误，保证进行充分的调查。                                 

（C）质量管理部门有责任批准或拒绝影响药品的组分、含量、质量和纯度的所有规程或规格

    （d）质量管理部门的职责和规程应写成书面文字；这种书面规程必须遵照执行。     

    211. 180（e）                               

    这部分规定的书面记录必须予以保留,记录中的数据可用于评价（至少每年一次）各种药品的质量标准，以确定是否需要改变药品规格、生产规程或检验规程。必须制订进行这种评价的书面规程并遵照执行，书面规程要包括下列规定：

    （1）审查每批药品，无论是被批准的或未得到批准的，必要时审查与一批药品有关的记录。

    （2）审查提出的意见、药品的收回，退回的或退工处理的药品，及按照 211，192规定对各种药品进行调查研究。

 

    606．100（b）

    制订标准操作细则应坚持包括所有步骤，即同种输血、自体输血及供进一步生产用的全血或成分血液的采集、加工、配型试验、贮存及运销。这样的细则应供给从事这些操作的员工，不合实际的除外

 

      211 100 

    （a）必须制订生产和工艺管理的书面规程，以保证药品具有声称的组分、含量、质量和纯度。这些规程要包括本部分中的所有规定。这些书面规程，包括任何改变，要由适当的组织机构起草、审查和批准，并回．要经过质量管理部门审查和批准。

    （b）在执行各种生产和工艺管理的职责时要遵守生产和工艺管理的书面规程，并且在执行时要做记录。偏离书面规程时要进行记录并说明理由。

 

   606．100（c）

    签发任何一批成品前，都应复核依据相应规程（例如 600～800条款）而保存

的所有有关的记录。全部或部分复核工作可在采血、加工、配型试验、或贮存

阶段的合适时间进行。对任何未能解释的差异或达不到规格标准的批号要进行

全面调查（包括追踪过程及结论）并记录归档。

 

      211．192

所有药品的生产和检验记录，包括包装和加标签的记录，在一批药品准予发放或销售前，必须经质量管理部门审查批准，以确定是否符合所有制订的，批准的书面规程。任何未说明原因的差异（包括理论产量百分率超过总生产和检验记录中规定的最高或最低百分率）或一批药品或药品的任何原料不符合规格，无论这批药品是否已经销售，必须进行彻底的调查研究。与不符合特定规格或特定差异可能有关联的其它各批药品和其它各种药品也必须进行调查研究。调查研究必须有书面记录，包括结论和措施。

 

 

    复核记录根据211．192条例的特殊限定；可由QC／QA部门负责进行。QC／QA部

门可由QA专职的一个或数个人员组成，也可由本机构内履行其它职能的非专职人员组成。但是，后者对其本身工作不具有终审权。

    应有在紧急情况下制品签发办法的SOPs。

    将生产过程记录及实验室检验记录复核后的记录归档应包括执行复核人员名单和签名以及复核整个原始记录而不是附属于某个批次结果的复核人签名。

应根据SOPs的要求指定复核人及制定复核的标准。

    211．194（ a）

    （a）实验室记录包括保证符合已制订的规格和标准的全部完整的检验（包括检查和分析）的资料。

    (7）每个检验人员签名及完成日期。

（8）依照制订的标准，由另一人员复查原始记录的准确性和完整性，复查人签名。

 

 

      211．15

    (a）必须制订书面规程。规定为符合标准或规格的一批药品进行再加工的制度，并规定应采取的措施以保证再加工的药品符合所有确定的标准、规格和特征，这种规程必须遵守执行。

    (b）不经质量管理部门的审查批准，不得进行再加工。

 

      606.20（b）

    负责采血、加上、配型、贮存及运销全血或成分血液的人员，无论在人数、教育程度、训练及经验，包括必要的职业训练等方面，都应适当，使他们有能力完成所承担的任务，使成品的安全性、纯度及效力达到规定的水平或应有的水平。所有员工应具有与职务相称的能力，通晓他们所从事的生产或检定操作，在本职工作中运用本章各项规定方面，有必要的训练或经验；有适当的知识。

 

      211.25

    （a）每位从事药品生产、加工、包装或仓贮工作的人员应接受培训、教育及有实践经验，完成委派的各项职务，培训是按照现行GMP（包括本章中的现行GMP条例和这些条例要求的成文程序）中涉及雇员的内容。邀请合格人员指导，并连续多次培训；保证雇员熟悉现行GMP（cGMP）对他们的要求。

    （b）负责监督药品的生产、加工、包装或仓贮工作的每一个人员，应受教育、培训及有经验，完成委派的各项职务，以此作为提供药品具有安全性、均一性、效价或含量、质量及纯度的保证。

    （C）有足够执行和监督每种药品的生产、加工、包装或仓贮的合格人员。

    606.20（c）

    对制品的安全性及纯度有不良影响的人员应从全血或成分血液采集、加工、配制、贮存或运销场所调离。Federal Register（40FR53534，1975年11月8日）陈述，本规范的目的是将影响别人完成职责或是影响产品安全性和纯度的人员（例如；在未采取防范措施的情况下，工作人员从检验区到生产区）调离生产区。

 

      211．28

    （a）从事药品生产、加工、包装或仓贮的人员，应穿着适合于其履行职责的清洁衣服。按需要，头部、脸部、手部、臂部加外罩、防止药物受污染。

    （b）人员保持良好的个人卫生和健康。

    （C）未经监督人员充许，其他人不能进入限制进去的建筑物和设施。

    （d）任何人，在任何时间，明显地表现出带有影响药品安全性和质量的疾病或开放性损伤，应避免接触各种成份、药品容器、包装设备、密封件、中间体、直至病愈或经医学测定认为对药品安全性及质量无危害性时为止，教育所有人员，报告监督人员对药品有不利影响的健康情况。

    606.10和6O6.20条描述负责人的职责是确保上岗人员经过适当培训并能胜

任其职责。

 

    211.34顾问

    为了对问题提出意见，聘请顾问。顾问应对药品生产、加工、包装或仓贮提出建议，他们受过足够的教育、培训、且有丰富的实践经验。保留他们的姓名、地址、任何的顾问资格及服务形式等履历资料。

 

    606．40（b）描述对充分通风的要求。

    211．46描述进一步详细的通风控制步骤。

 

      211．46

    (b）提供足能控制空气正压、微生物、尘土、湿度和温度的设备、适应药品生产、加工和贮存之需要。

    （C）空气过滤系统，包括预过滤器和微粒物质空气过滤器。空气经过滤才送至生产区，如果空气是再循环到生产区，应测量尘埃含量，控制从生产区带来之尘埃。在生产区，生产中发生空气污染，应以排气系统或其他系统充分抽出空气，控制污染。

 

      211．48

    （a）在持续正压下，应对药品无污染的管道系统内供应饮用水。饮用水应符合环境保护机构制订的“基本饮用水条件”标准 （40CFR141部分）。不符合该标准的水。不许进入水系统。

    （b）排水设备应有足够的大小，可直接连接排水管及安装防止虹吸倒流的空气破坏设备或其他机械设备。[43FR45077，1978年9月29日，修正于48FRll426，1983年3月18日］。

    21CFR606．40（ c）

    应为工作人员安装充足的清洁方便的洗手装置。

    提供适当的洗涤设备；包括热、冷水、肥皂、清洁剂、空气干燥器或专用毛巾及易进入的清洁厕所设备。

 

      211.68

    （a）用于药品生产、加工、包装和贮存的自动化、机械化或电子设备，包括计算机或其他类型的设备。按惯例，对其设计之成文条款作标定、检查或核对，保证其工作性能良好。保留检查、标定、核对等文字记录。

    (b）对保障重要生产变化的计算机或有关系统进行操作培训，操作记录或其他记录只能由被认可的人员制订。向计算机或有关系统输入或从中输出的各种方案，其他记录或资料，应该查其准确性，输入计算机或有关系统内的档案资料，除与实验室共同分析计算的结果可消除外，其他的应保留。文字记录与相应的证明资料一起保存。事先设计好的硬件复制品或多种选择系统，如复印件、磁带或微型胶卷等，保证其支持资料正确，可靠及完整，出现资料改动、非人为消除或遗失时，应维修。

 

    606．40（d）

    提供安全卫生的处理设备，用预处理

    （1）全血或成分血液采集、加工及配型试验过程中形成的垃圾及用过的纸制品

    （2）不适于应用或运销的全血或成分血液。

      211．56

    (a）所有用作药品生产、加工、包装及贮存的厂房应保持清洁、卫生的环境、且不受咽齿动物、鸟类、昆虫及其他害虫侵扰（实验动物除外）。垃圾和有机废料，定时以卫生的方法控制与处理。

    606．60

    (a）采血、加工、配型试验、贮存及运销全血或成分血液用的设备应保持清

洁、有秩序，其放置位置应便于清洁及保养。设备应按标准操作规程定期进行检

查、标化及校正。设备的设计应符合本章有关全血及成分血液用设备的正式规定。

    606．100（b）（15）

    要求SOPs应包括对仪器设备的维护及校准的及程序。

 

      211．67

    (b）制订药品生产、加工、包装或贮存设备（包括用具）的清洁和保养文字程序并且执行。

这些程序包括，但不一定限于以下内容：

    （1）分配清洁、保养任务。

    （2）保养和清洁细目一览表，包括消毒一览表。

    （3）详细说明用于清洁和保养的设备、物品和方法。拆卸和装配设备的方法必须保证适合清洁和保养的要求。

    （4）除去或擦去前批遗留物的鉴定。

    （5）已清除了污染的清洁设备的保护。

    （6）使用前检查清洁的设备。

    （C）保留保养、清洁、消毒的记录，按211．180及211．182的说明检查。

    211．105（b）

    （b）一种药品每批生产使用的主要设备，以一鉴别性识别号或代号加以识别，此鉴别号或代号记录在该批产品的记录上。若生产中只使用一种特殊型号的设备，可用该设备名字代替鉴别性识别号或代号。

    606．100(b）（16）

    要求有书面的SOPs，内容包括贴标示程序后避免标签混淆的保障措施。

    606．120

    （b）贴标签操作应进行下列控制：

    （l）收到标签时，应按已批准的最后副本复查及校对，在制品的品种及标签的

内容上保证与已批准的副本准确一致。

 

      211．122

    (a）制订详述标签和包装材料的接收、鉴别、贮存、装卸、取样检验的程序，并遵循这些成文程序。在接收、用于药品包装和贴标签前，有代表性地对其取样与检验。

    (b）符合成文规格标准的标签和包装材料，可批准发放使用，不符合规格者，不得用于生产。

    （C）接收每批不同的标签和包装材料，均须签收、测试、无论是接收或拒收、须保留其记录。

 

    606.100（b）（16）见上述

    606．120（b）

      （2）不同制品的每一种标签的保存及管理，应避免混淆，废标签应销毁。

    （3）在贴标签程序中应有必要的全面核对措施，对特殊标示程序及标示设备应有相应的控制程序。如果自动标示设备仍然使用前一生产阶段的标示内容。从而可能造成下一阶段的标示出现差错时，应采取相应的措施防止出现此类情况。

    包装见606．65（a），无热原容器见60665（b），外观检查见606.100（b）（13）。由

单位血液追查献血员的程序及成品容器见640 2（C）

    211．125标签的发放

    (a）严格控制已发放的，用于药品的标签。

    (b）已发放的一批标签材料，须认真检查其均一性，应与一批或单批生产记录中说明的标签一致。

    （C）核对发放的，已使用的及回收的标签，若发现成品数量与发出的标签数量不符，差额超出根据历史水平先前定下的数量范围，则需对这些偏差做出评估，按照211.192要求调查原因。

    （d）超出有关批号或控制号的标签，全部应毁。

    （e）回收的标签，如保留应加上证明标志贮存，防止混淆。

    （f）制订发放标签的详细控制程序，并遵循。

  211.130包装和标签操作

    设计保证标签，标示及包装材料正确用于药品的程序,并遵循。这些程序结合下列特点：

    (a）预防混合和由物理的或其他操作空间物质引起的交叉感染。

    (b）带批号或控制号药品的鉴别。允许检查该批药品的制造和控制历史。

    （C）包装工作开展前；检查包装和标签材料的适  用性和正确性，且这些检验所提供的证明文件应  符合批生产记录。

    （d）使用前，立即检查包装和贴标签设备，保证所有药品离开先前的操作，同时移开不适用于随后操作的包装和标签材料，检查结果以批生产记录形式提供证明文件。

    211．134药品检查

    （a）已包装和贴标签的产品，在结束工作时，应检查，保证本批容器和包装的标签正确无误。

    (b）操作结束时，每组收集一个代表性样品，同时检查标签。

    （C）检查结果记录在该批的生产或控制记录中。

    606．40（a）（4）

    初次血清学试验结果可疑，在重试前；于指定位置贮存待检全血或血液成分。

    606．40(a)（6）

    用于隔离贮存、管理、处理不适合应用的制品及试剂。

      211．142

    制订和遵循药品入库程序、包括：

    （a）药品发放前，由质量控制部门待检。

    （b）药品在适当的温度、湿度和光线下贮存，不影响药品的均一性，效价或含量，质量及纯度等。

 

    血液、血液成分和进一步加工产品的规格和标准见600s．606．140

    实验室检定程序应包括：

    （a）实验室科学可靠，有适宜的规格标准及试验检查细则；以保证全血及成分血液的安全、纯度、效力及效果；

    (b）为了监控实验室检定操作及仪器可靠性、准确性及精密度，应有适当的规定。

    （C）充分鉴别及管理检定样品，使样品与特定的待检制品单位相联系；或与其供血者、或与特定的受血者相联系；

    606.60

    （2）仪器的检查、标化及校正应达到下达次数，但不限于此……

 

    211．160

    （a）按本部门的要求，制订规格、标准、取样方法、试验程序或其他实验室控制机制，包括上述内容的修改，由有关部门起草和复查，并经质量控制部门批准，遵守本部门中各要求，在实施时，提供证明文件，任何对成文的规格、标准、取样方法、试验程序或其他实验室控制机制的改动，应作记录，并提供证明这些改动是正确的。

    （b）实验室控制的内容、包括科学地制订完善、合理的规格、标准、取样方法及为保证各种成分、药品容器、密封件、中间体、标签和药品符合均一性、效价和含量、质量与纯度标准而设计的检验程序。实验室控制包括：

    (1）根据接收的成文规格、测定用于药品生产加工、包装及贮存的每装货量中的每批的成份、药品容器、密封件和标签。保证它们符合制定的规格标准、此规格包括使用的取样和检验程序说明，样品有代表性及经适当鉴别。这些程序亦要求对任何变质的成分、药品容器或密封件作重复检验。

    （4）若仪器、设备、量具和记录装置的准确度和／或精密度范围不符，按照制订的成文方案。包含具体说明书，一览表，准确度和精确度范围及治疗作用条款，在适当时间间隔内，对这些仪器、设备进行标定。不符合已制定规格的仪器、设备，不能使用。

    产品的规格标准是指对要求或建议的病毒标志物检查质量控制检定以及与血液机构自身的 SOPs列出的试验要求结合在一起的其它试验检查。合格标准由产品规格确定。

 

      211．165

    （a）发放前，每批药品须经实验室测定，保证其符合药品的最终规格标准，包括特性和活性成分的含量。对有效期短的，需无菌和／或热原试验的放射药物特殊批号，可在上述试验完成前发放。规定尽快完成试验。

    （d）对质量控制部门的取样和检验的接收标准是满足保证那些药品批号符合各自的规格标准和统计学的质量控制标准。这些标准是批准和发放药品的条件，此统计学质量控制标准包括适当的接收水平和／或适当的拒收水平。

    （e）证实和提供文件，证明经严格使用的检验方法的准确性、灵敏性、特异性和重复性。此验证和证明，可按照 211.194(a）(2)项完成。

    （f）不符合制订的标准、规格和其他有关质量控制标准的药品，应拒收，但可返工。待返工的药品，在接收和应用前，须符合标准、规格和其他有关标准。

 

    606．120（a）（1）

    收到标签时与样本标签核对，保证收到的标签特性,内容准确无误，与样

本标签完全一致。

    606.160（b）（20）（v）

    提供保存贴标签的记录，包括负责人的签名。

      211.184

    (d）按 211．122（C）和 211.130（C）制订的规定，检查或复查标签和贴签所提供的文件。

 

  生产和质控主记录应包括211．186（a）项要求的签名

 

      211.186

    （a）保证批与批间的一致性，制备各批药品的主要生产和控制记录（包括各批的量）、由一个人填写日期和签名（全名；手签）。由另一人单独核买。填写日期和签名，此主要生产和控制记录的制备，由一文字加以说明，并要遵循。

    606.160（a）（6）描述了关于保存记录的要求，对血液及血液成分批次产品的记录不要求都记入同一记录内。生产过程中的每个重要步骤的记录应易于查找。

 

      211．188

    每批生产的药品有批的生产和控制记录，包括每批有关生产和控制的完整资料。这些记录包括：

    （a)适当的主要生产或控制记录、复查、注明的日期及签名的准确复制件。

   (b）完成本批的生产、加工、包装、贮存中各项重要措施项提供的资料，包括：

    (1）日期。

    （2）使用的重要设备和生产线的特性。

    (3）每批使用的成品或中间体的具体鉴别。

    （4）加工过程中使用的成份的重量和容量。

    （5）加工过程和实验室控制结果。

    （6）使用前、后，包装和贴标签地区的检查。

    (7）在适当加工阶段，实际产量的说明和理论百分数的说明。

    （8）完整的标签控制记录，包括全部使用的标签样本或复制件。

    （9）药品容器和密封件的说明。

    （10）已经完成的取样;

    （11)生产中、执行和直接监督或复查各个重要过程的人员身份证明。

      (12)对任何的调查，按 211.192进行。

      （13）检查结果，按211.134处理。

 

 

    606.170

    对于因每批次血液或血液制品的采血或输血而涉及到产生不良反应的任何投诉报告均应记录保存。对每个不良反应报告都应全面调查，对不良反应应写出书面的调查报告，包括结论及调查过程，并由采血或输血部门将其做为该批成品记录的一部分归档保存。当确定是由产品的问题引起输血反应时，所有此类书面报告的复印件都应送交生产或采血部门并归档保存。

    (b）当证实采血或输血的并发症是致命性反应时，应以电话或电报尽早通知生物制品评价及研究中心所属办公室主任；当出现献血员反应事件时，由当事的采血部门；或者发生输血反应时由执行配型试验的部门于死亡发生后7天内向生物制品评价及研究中心办公室主任提出书面调查报告。

 

      211．198

    （a）制订和遵循用于说明处理与药品有关的全部文字和口头投诉的成文程序，此程序包括经质量控制部门复查这一条款。任一投诉中，药品有任一项不符合其规格的可能性，则根据211．192，对该药品进行测定，作一调查。这些程序还应包括复查条款，检查此投诉是否再出现严重的和意外的不良药品反应。根据本章310.305，不良反应须向FDA报告。

    (b）每个投诉的文字记录保存在药品专用档案内，与该药品投诉有关的档案，保存在生产、加工或包装该药的企业中，若存放于别的地方会更有利于检查，则可在那里保存。涉及一药品的文字记录，从该品的有效期满计，保存一年以上或从收到投诉日期计，保存一年，不管哪个较长，由时间较长者决定。在某些缺少有效期的非处方药品的情况下，由于它们符合211．137中的免除条例，故这些文字记录的保存时间应是从该药品销售后三年。

    （1）投诉文字记录包括如下资料：发现地方、药品名称、含量或效价、批号、投诉者姓名、投诉性质及投诉答复等。

    （2）执行2ll．192中的调查，报告包括此调查和跟踪中的发展。调查报告记录或其复印件，根据211．180（C），保存在作该调查的企业中。

    （3）若没有执行211．192中的调查。此文字报告应包括没必要调查的原因和负责此检查的负责人姓名。［43FR  45077．1978年9月29日，修正51FR24479，1986年7月3日］。

附录B关于系统表格

表1质量保证

重要控制点：QC/QA部门与生产部门分开

关键因素：目标／政策

          产品规格标准／验证

          标准操作细则

          岗位／职员QA、CGMP培训

          任职考核/熟练程度考核

          遵守 CGMP

重要控制点：质量控制

关键因素：产品检验

          仪器设备检验

            试剂检验

重要控制点：QA审计

关键因素：独立和集体工作系统

            限定范围

          预警水平/行动水平

          书面审计报告

          评价报告／资料分析

          信息反馈

          纠正行动／追踪调查

重要控制点：投诉／产品缺陷/不良反应评价报告

关键因素：评价程序，包括因果

          差错和事故报告

            实验室差错报告

            献血员招回（献血后资料）

            使用者投诉

          输血后疾病/其他不良反应

            适时评价

          追踪调查/问题的解决

重要控制点：信息流

关键因素：定期审查厂家的要求，有关“修改”的审查及将其纳入 SOP的生产指令

            颁布新SOPs废除旧 SOPs的程序。

          向实际使用者提供新修改的内容，包括所有换班/辅助人员

          FDA致有关人员的信函。

          管理人员准确/及时收到信息

重要控制点：仪器设备保养／维修

关键因素：认证/验收试验

          预防性维护

          常规／定期保养

          保养记录

          维修后认证／验证

          维修记录

表2献血员合格标准

重要控制点：献血员征集

关键因素：教育

重要控制点：献血员注册

关键因素：献血员提供的准确资料

          输入档案的准确资料

          持卡人查用／永久有效

          防止已知不合格献血员献血的办法（例如在注册时或发现后立即延

          缓献血员注册）

重要控制点：献血员筛选

关键因素：保密

          有效沟通

          坚持所有健康史及筛选指标

          仪器／试剂

          献血员同意书

          质量控制

          记录审核

          爱滋病教育／高危行为问题

          献血员医学史／献血员体检

          保密部门剔除（如果实行）

重要控制点：献血员的认可

关键因素：认可标准

          授权者文件／主管人员认可

重要控制点：献血员延缓注册（DDR）

关键因素：准确信息／阳性鉴定

          献血员暂缓注册，或采血后但未进一步处理前应延缓注册咨询。

          解决分歧意见

          更改信息

          加入／删除信息

          查出及解决重复的信息

          传递信息

          审查记录

          资料评估

          永久或临时状况

          资料检索

重要控制点：献血员延缓献血

关键因素：通知献血员／卫生当局

          复查

          咨询

          教育

          再认可步骤

表3采血

重要控制点：血液、血液成分、原料血浆采集

关键因素：确认献血员、血液容器、小样、血液成分、记录

          验证献血员与血液容器、小样、血液成分、记录相一致

          采血部门（手臂）的处理

          设备／供应物／IV溶液

          采血装置／容量类型

          献血员不良反应

          过量出血／出血不足

          产品规格标准

            自动采血

          收集多种血液成分

          保留成分的容积／还输给献血员容积

            物料故障

          程度差错

            记录审核

重要控制点：献血员免疫方案

关键因素：抗原的安全性、纯度及效力

          抗原选择、接种/方案/剂量

          献血员抗体产生及评价

          标示可用／废品的标准规格

          低滴度及其它不合格产品的废弃处理

            献血员医史审核

            不良反应

            产品记录审核

表4血液成分加工

重要控制点：血液成分制备

关键因素：血液制品原料合格标准（例如延长采血时间，合格的献血员等）

          制备时间／温度/设备／重量或体积

            规定失效日期

          抗凝剂／添加溶液/容器

            无菌连接装置/合并装置／其它装置

            记录审核

            质量控制（包括取样量）

            所有产品的处置

            运输、保存湿度

          离心条件

          人员／设备标示

重要控制点：手工标示

关键因素：使用前验收标签

          产品的失效日期

          标签正确标示的核实

          标示记录

重要控制点：计算机控制标示

关键因素：竖条编码（条形码）

          标签控制，前后协调

          在线打印装置

          根据需要／批次打印

重要控制点：待检

关键因素：保存未检定，正在复试

          有生物危害，不合标准，不适用于输血

          自体、定向（directed)产品的位置

          加工记录审核/第二人审核

          消毁或其它处置／记录

          设备

重要控制点：无菌连接采血装置

关键因素：焊接完整

            导管系统

表5产品检验/相容性

重要控制点：样品

关键因素：查验／采集/标示

          完整性（稀释、污染）

          查找丢失样品/样品次序

          厂家的说明/血清或血浆

          贮存时间及温度

          记录／样品获取

          运输条件/转运时间

          样品保留

            处理

  重要控制点：试剂

  关键因素：接受记录／运输条件

            检验前验收批号／未检材料的待检

            贮藏条件及记录

            厂家的使用说明

            质控检验/每日进行/验收新入库试剂

            内控检验的使用／稳定性／重复性

            记录差错或问题/向厂家报告

    重要控制点：设备（在某些情况下包括软件）

    关键因素：用途／设计

              两表面间相容性（如适当）

              认证及校正

              维修、保养

              人员培训／新设备介绍

              验证

              平行测试

              质控

                记录

              备用程序

              记录问题并向FDA报告

    重要控制点：实验室检验

    关键因素：样品标示／有序放置/完整性

              试剂盒控制／数据计算/说明

              反应性／阳性检验结果／确认试验

              试验不成立／问题

              复试／检验结果

              检验中断／启动/关机／其它方法

              查找丢失的试验结果

                记录

              QA在签发检验结果中的作用

              培训/任职考核

              熟练程度考核

    表6签发产品批

    重要控制点：验证标签内容

    关键因素：记录审核：无论是要求或建议的全部检验均应依据SOP及厂家的说明进

              行，并结果符合签发要求。

              记录审核：完成全部质控，而且结果应在可接受的范围内。

              记录审核：签发每种成分前审查所有生产记录并经专职负责人批准。

              记录审核：标明正确的失效日期，所有审核记录归档。

    重要控制点：献血员适合条件

    关键因素：记录审核

                延迟注册

    表7贮藏及分发

    重要控制点：产品贮藏

    关键因素：产品位置／地点／次序

              待进一步加工的产品

              待检（physical VS ComPuter）

              末检，正在重试，生物危害，不符合规格标准，不适于输血，自体，

          定向产品

          供分发的产品

          供交叉配血的产品

          设备

          温度

          警报系统

          记录审核

重要控制点：销售

关键因素：记录审核

          失效日期

          外观检查

          包装/目的地

          运输容器验证

          运输温度

          记录

表8系统计算机

重要控制点：文件

关键因素：硬件一列出设备，安装日期，序列号，保养记录，电学及环境要求，

          安装说明，保养日程表及程序清单

          软件一列出程序，程序总描述，程序之间相互作用研制、修改、文

          档、检验计划、检验审核及评价的清单

          执行日期

          部件及系统验证

          人员／SOPs

          培训计划，大纲及文件

重要控制点：计算机系统的检验

关键因素：研制及维持检测数据库／检验计算（SOPs）研制及维持包括正常、异

          常、临界、应力及不合格检验等情况。

          执行检验及记录结果

          平行检验

          明确及记载检验程序的评价

          由于执行检验而进行的文件修订

重要控制点：执行

关键因素：定义及记录执行程序

          仪器连接仪

          改变控制

          批准程序

          备份及贮存程序

          数据转换程序

          检验停工程序

          软件文档（合适情况下）

          安全性／口令

重要控制点：维修

关键因素：硬件

          应用及操作系统软件

          改变控制

          批准程序

          文档

          备份及贮存程序

          常规验证数据及系统

    另外，请参照标示计算机化的重要控制点，表4部件加工及仪器设备／软件，表5

  产品检验。

    名词解释

    行动水平：指需要立即找出偏差来源的限度，并据此做出必要的修正以避免产

品质量受影响，由QC／QA部门批准及评价该限度的执行。

    示警水平：需要查找及修正潜在问题的限度，但并不表明对产品质量已产生影

响，QC／QA部门批准及评价该限度的执行。

    验证：见质量保证验证

    任职考评：评价某入胜任指定任务的内在过程。可以使用各种考评方法。

    成分（部件）：（1）由物理或机械方法分离的一批血液的某种成分[见21CFR606．3

                    （ c）］

                  （2）任何用于生产某种药物的成分，包括那些未出现于成药中的

                  成分[见CFR210．3（b）（3）］

                  （3）一台仪器或一种与计算机系统相联系的软件或部件。

    计算机修改控制：在计算机系统或数据库中查询、评价、协调、执行、记载至获得正式批准修改的过程。

    重要控制点：加工过程或生产过程的一个功能或区域，如果发生失调或失控可能会对成品产生不良影响从而危及健康。

    现行药品生产管理规范（cGMP)：加工、生产、包装或贮藏某种药品，包括但不限于血液制品所使用的方法、设备及控制以保证其产品安全性符合FD＆C法的要求，具有特性及效力，达到其应有的质量及纯度特性[见Fh＆C法，第501(a）（2）（B）部分］。CGMP确保产品的恒定生产及始终受相应的质量标准控制。它包括生产及质量控制／质量保证过程。

    关键因素：生产过程中重要控制点上的一个步骤。

    维护保养：调节、清洗、修正及彻底检修设备及保证其按照要求运转。软件系统的维护保养还包括修正软件差错，调整软件使之适应于新环境或对软件做增强处理。

    生产：血液由机体产生，安全输血前需进一步处理。生产这一名词由21CFR600．3（u）在某种程度上定义为扩增或生产及加工产品过程中的所有步骤。生物制品规程对加工血液的每个方面，甚至在血液采集前都提出了相应的要求，FD＆C规程及PHS规程（例如献血员合格条件部分中）“生产”名词也直接用于血液及血液制品（40FR53532，1975年11月8日）。

    平行试验或平行运行：同时使用两个或两个以上的不同系统进行功能检测。它可以包括建立的系统与新系统比较（国际标准化组织定义：在新的或改变了的数据处理系统上有其它系统上使用的相同数据进行检验时，而其它系统则视为参比标准。）

    制造：给予那些参与生产的人员或生产有关的实际操作的总名称。

    资格检验：通过对外源定期提供求知样品的分析评价在精确度合格范围内的实验操作能力。

    程序描述：说明计算机程序功能以及与其它程序相互作用的描述。

    测试：对加工仪器、试剂、附属系统能否在确定的限度及耐受范围内发挥正常功能的确认。程序测验是用来确定该程序的有效性及可重复性。

    质量：产品或加工程序与预先确定的规格标准的一致性。

    质量保证（QA)：为确保影响产品质量的所有体系或因素按照单独或共同的要求发挥作用而进行的计划或采取的行动。

    质量保证程序：根据规程标准，一个机构为安全有效生产合格产品而建立的保障体系。该程序包括预防、探测及校正可能影响产品质量的缺陷。

    质量控制／保证（QC／QA）部门：由一个或多个人组成，依靠明确的权力及责任进行管理，直接向上级权力及责任部门汇报，保证在机构内贯彻执行所有的产品保证政策的管理机构。

    质量控制（QC）：是QA体系的一个组成部门，主要是在生产血液制品过程中（包括检验及分发过程），采取控制措施确保机构的人员、设备、试剂及生产操作具有可靠性、准确性。

    规格：指某种产品体系或某部门体系的（适当情况下）物理特征及组成，表型特征、标准、要求、标准、预期功能、行为或其它特征。

    不同测试实例（应用到计算机化系统）

    正常值：使用有效的数据组产生正常输出

    意外值：有效数据产生了非正常扭曲迫使程序做出相应反应。

    临界值：迫使程序对具有临界含义的情形做出评估的数据或介于预置的告警水平与行动水平之间的数据。

应激值：迫使系统达到极限水平的数据（在渐进阶段及用户环境中）

错误值：错误的数据，检测数据的设定应迫使程序证明它能探测到错误数据并做出适当反应。测试不合格情形可以包括提供日期错误，例如 02／30／91； ABO血液错误，例如“P”型；还有象血红蛋白负值；或无资料输入。

    测试数据库：通过复制生产数据库及加入异常的数据使数据库包含有正常及异常数据。测试数据库是在判断有效或/和认可试验中用于检测计算机化系统。

    限定值：记录时为确定功能状况所需要的导向性数据。

    它是决定是否采取干预行动的质量合格限度，可以用数字或百分比表示。

可信性：它是指认可的文本证据，能对某种特殊工艺持续生产出符合预先规格及质量要求的产品提供充分保证，通过验证其预设工作的有效性评价体系的可信性。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

利用中试生产设施开发和生产生物制品的指南

（ FDA，CBER，1995，6，26）

FDA宣布利用中试生产设施开发和生产生物制品的指导文件已经出台。题为“利用中试生产设施开发和生产生物制品的指南”的指导文件是由生物制品评价和研究中心（CBER）制定的。该指南阐明了生物制品生产厂家利用小规模和中试生产设施开发和生产生物制品申报许可证的要求。制定该指南的目的在于既不削弱公共卫生保护作用．又提高工业的灵活性。

CBER认为重点新生物制品的开发是昂贵和费时的，公司应能预测和估价此过程的花费。为生产临床试验尚未全部验证的制品而建造新的生产设施，在制品最终不能投放市场的情况下，可使公司导致主要投资损失。CBER还认识到，对某些公司而言；最佳的财政选择是利用中试生产设施生产较小规模的产品，而不是为待批准的产品投资建厂。

CBER不反对利用中试生产设施生产临床用制品。不少公司担心这类设施不符合申报生产企业许可证的要求。指南明确阐明了中试设施适合申请生产企业许可证，其指导原则是任何经认证和验证的并且按现行GMP规定作业的，或按相应的法律和法规运行的设施，（不论生产规模大小），均可申报生产企业许可证。为了进一步简化审批程序，FDA正在考虑改变某些特定类别的生物制品的申报程序，取消单独的生产企业许可证的申报要求。由于现代科学在生产方法和分析方法上的进步。某些通过生物技术开发的产品是经鉴定的，因此其考虑方法可不同于以往。FDA正在考虑允许将已充分鉴定的生物制品按一次性申请规定管理。FDA计划在 95年秋季召开一次科学会议，制订已充分鉴定的制品的定义，并将其纳入新程序管理范畴。

    本指南描述了中试生产设施企业许可证（ELA）的申请条件和步骤，以及后期转让至不同生产设施进行产品生产的申请条件和步骤。本指南提供的信息如下：

    1）采用中试生产设施生产的制品进行临床试验，证实其安全性、有效性以及过渡到不同生产设施的最佳选择。

    2）利用中试设施生产制品应提交的申报审批材料。

    3）在中试设施生产的制品许可证（PLA）和中试生产设施企业许可证（ELA）尚未批准之前，申报不同生产设施生产企业许可证应提交的审批材料。

    4）当产品和中试设施均已获得许可证后，申报不同生产设施的生产企业许可证应提交的审批材料。

5）当不考虑中试产品及中试设施的许可证申报问题时，根据中试产品资料申报产品许可证（PLA）应提交的审批材料。

本指南还阐述了审批和申报的时间要求，以及制品的一致性、不同设施生产制品的对比数据及在制品许可证有效期内的制品的可用性。

另外，为配合改变的程序，FDA准备修订题为“已获得许可证的生物制品的生产安排”的政策文件，该文件出版在1992年11月 25日的联邦注册录中（57FR 55544）。

本指南对FDA或生物制品生产厂家均不具有约束力，对任何人均不产生或授与任何权利或特权，或受利于任何人。

I前言

生物制品一般包括疫苗、血液和血液制剂、变态反应原提取液和生物制品治疗制剂，归公共卫生法规（PHS Act）（42USC262）第351节项下管理，也归联邦食品、药品和化妆品法规（21USC 321）管理。 PHS法规定生物制品的增殖或制备和生产应在持有末终止的和未撤消的生产企业许可证的厂家中进行。由于有关许可证的发放要求尚欠明确，致使有些申请者在开始必要的制品的安全性和有效性的临床试验前，将大量资金投入大规模生产设施。如果产品最后不能投入市场，如此投资可能造成重大的经济损失。在此文件中，CBER为生物制品的生产者和开发者利用中试生产设施生产生物制品提供了许可证发放步骤的指南。CBER认为中试生产的程序和设施完全代表和模拟了相应的商业化生产规模的需求。例如，除生产规模外，细胞的增殖、收获、和产品纯化的方法应完全相同。这类生产设施在工业上统称为“试验性设施”（“Pilot facilities”），在此文件中，称之为“中试”（“Pilot”），这类生产设施区别于研究开发用设施，后者可不必在现行GMP条件下操作。

Ⅱ背景

CBER认为重要的新生物制品的开发可能是既耗资又费时的，公司必须能够预测和评估此过程的花费。建造大规模的生产设施生产尚未经全面临床验证的制品，如果发生延误，或制品最后不能进入市场，将可能导致大量资本的损失。CBER认为，对某些公司而言，最佳的财政选择是利用中试设施较小规模地生产制品，而不是为待批准的产品进行投资建厂。同时，CBER不反对利用中试设施生产临床制品（如果此类制品的生产符合临床观察用药品的要求）。不少公司担心中试设施以及中试产品不符合许可证申报要求。CBER认为，任何经认证和验证的并且按现行GMP规定作业的，或按相应的法律和法规运行的设施，（不论生产规模大小），均可申报生产企业许可证。本指南描述了中试生产设施许可证（ELA）的申请条件和步骤，以及后期转让至不同生产设施进行产品生产的申请条件和步骤。

Ⅲ 指南

本文为中试生产设施的产品许可证申请（PLA）、生产企业许可证申请（ELA）及试验性新药（IND）的申报提供了指南。

    1．利用中试设施生产的产品进行临床试验以证实其安全性、有效性以及过渡到不同的生产设施的最佳选择。

所有制品的试验性新药（IND）的申请材料应包括用于临床观察以证实安全性和有效性的制品的产地。生物制品许可证的申请材料可采用中试设施生产制品的数据。如果在新设施及扩大规模的工艺或设施中生产的制品，将用于临床的安全性及有效性验证，或作为申请许可证产品，那么在IND申请中应对时间表、新厂址和工艺过程加以阐明，同时还应提交产品比较草案，用新设施或新工艺生产的制品与先前临床试验的制品的对比资料，应在对新制品进行临床试验之前提交IND，如果新设施或新工艺生产的制品，不准备用于安全性和有效性的临床验证，应在IND、PLA或PLA增补案中提交这两种制品的比较材料。在IND或PLA申报中，还应包括由于采用新的生产工艺或设施而产生的任何生产变化的描述，及其稳定性资料。

    2申报中试设施产品许可证的审批材料

用中试设施生产的制品的资料和数据作为PLA申报材料。ELA应包括全套FDA 3210表；包括中试生产设施描述的生物制品生产企业许可证申请表（FDA3210）。如果生产设施已获得许可证，应提交一个包括特定新制品的ELA增补案。设施和设备不论其规模大小，应经过适当的认证和验证，并应符合（但不仅限于）联邦法规21CFR第210，211，600和820节的规定。在审批PLA、ELA或ELA增补案前，应进行许可证发证前视察。可以先行申报 PLA或 ELA，如生产设施已就绪可供视察，可在PLA或ELA中提出声明，并说明提交另一份申请的大约日期。CBER拟在规定的正常审  批时间内，审批不同时间提交的PLA和ELA，（自CBER收到的申请日起，审查标准申请12个月，优先申请6个月，增补案6个月）。由于CBER通常同时批准ELA和PLA的申请，因此应注意提交两份申请的时间。对未能在提出标准申请6个月内或优先申请3个月内提交两份申请中另份者，CBER将视为申报不成立，并发给该申请者未批准函。

3．在中试设施产品许可证（ PLA）和中试设施生产企业许可证（ELA）尚未批准前，申报不同设施的生产企业许可证应提交的申请材料。

      在此情况下，可按本指南第Ⅲ章中第2节的规定执行。

      FDA对中试设施的视察可以或不必进行。除中试设施许可证外，申请者还要求取得不同设施的许可证。以下材料应在PLA被批准前申报：

    改变的生产过程的描述；

    新旧设施中生产的制品的比较数据；

新设施产品的工艺验证文件和稳定性资料。

CBER准备建立一个单独的 PLA档案制，将采用新的参考号和 6个月的复审规定。新的ELA应包括新设施介绍及全套ELA 3210表。如果新设施已经获得许可证，申请者应提交ELA增补案，并附有新制品资料。申报新的PLA档案、ELA或ELA增补案中，应包括可视察新设施的声明。对中试设施的共同复审将继续下去，直到申请者不再要求对批量中试设施产品投放市场前的审批。如果申请者不再要求发放批量中试产品许可证，申请者可以提出书面申请，撤回待批的ELA，但是FDA仍可对设施进行视察。在此情况下，中试设施生产的制品可用于其他临床试验，但不得投放市场。CBER将按新的申报时间要求和审查程序对新设施的ELA进行审查。CBER将发表新的参考号，并分别在 6个月、12个月和 6个月内完成对优先、标准和补充申请的审批。CBER打算在 6个月内完成对新的 PLA档案的审批。如果申请者提出两种设施许可证的申请，FDA将对两种设施进行视察。申请者应明确指出希望优先获得许可证的设施，CBER可集中其资源首先审核该项申请。

经审核通过，任何一种联合的产品及生产企业许可证的申请均可获准。在新生产设施和新设施产品尚未申报审批前，中试设施及其产品可以申请许可证。应注意的是提交申请的时间， CBER对新的ELA的审核时间（自CBER收到的申请日起，审查标准申请为12个月，优先申请6个月，增补案6个月）可能长于对新的PLA档案的审核时间。对未能在提出标准申请6个月内或优先申请3个月内提交两份申请中另份者，CBER将视为申报不成立，并发给该申请者未批准函。

4．当制品和中试设施均已获得现行许可证时，提交不同生产设施的许可证申请

      当申请者希望获得不同生产设施及其产品的许可证时，应提交已获准的中试设施产品的补充材料，以及新设施的ELA或ELA增补案。PLA增补案应包括新设施产品的资料，包括对现存的生产改变的描述（见“申报制品和生产企业许可证时应报告  改变的内容；指南”（60FR17535，4月6日1995））。应提供不同设施产品的比较数据，工艺验证材料，以及新设施产品的稳定性资料。如申报新的ELA，应提供填好的ELA 3210表格，并附有对新设施的描述。如设施已获许可证，应提交含新制品介绍的ELA补充材料。所提交的各类材料中应包括有关设施可供视察的声明。CBER将根据规定的复审时间，安排审批PLA，ELA及其增补案。（对生产和设施改变的复审需6个月时间）。当所有材料经审查通过时，CBER将同时批准ELA、PLA及其增补案。对未能在提出标准申请6个月内或优先申请3个月内提交两份申请中另份者，CBER将视为申报不成立，并发给该申请者未批准函。

5，不准备申请中试产品和中试设施许可证时，提交以中试产品为数据的PLA

CBER将允许在未申报中试设施许可证的情况下，申报以中试产品的临床试验资料为数据的PLA。为审核中试产品及用于临床试验产品与申报许可证的设施产品的对比数据，在申请者获得新设施产品许可证时，中试设施应具备供视察的条件。申请者可以在未申报设施许可证的情况下，以该设施生产的临床试验产品的资料申报产品许可证，但只有在批准的设施中生产的产品方可投放市场。PLA应包括中试产品的资料，以及在提交申请时要求视察中试设施的声明。如拟申报中试的代表产品许可证，在特定的时间内，中试设施产品的稳定性资料可用来做申报材料。另外的原设施的ELA可与PLA同时提交，也可以在开始对PLA审核后提交。应在申请许可证的设施投产后，并在该设施及产品可供审查之时提交ELA。如果ELA在开始审批PLA之后提交，申报材料应包括比较两种设施产品的PLA增补案，增补案应包括产品稳定性数据，工艺验证及生产过程中任何变化的资料。（见指南（60 FR 17535））。CBER将按规定的复审时间，对ELA和PLA进行逐一审核，（从CBER接受时间起，标准申请12个月，优先申请6个月，生产增补案6个月）。虽然ELA和PLA不必同时申报，但应提请申请者注意的是 CBER将同时批准IKLA和 PLA。对未能在提出标准申请 6个月内或优先申请3个月内提交两份申请中另份者，CBER将视为申报不成立，并发给该申请者末批准函。

6．不同设施产品一致性的论证和数据比较

当某种制品的生产从中试设施转移到另外的设施，应在PLA增补案中对制品一致性的论证、两种制品的比较及工艺验证加以描述，或对IND进行修正。应在控制的条件下，储存足够量的中试的保留样品，以便对制品进行的逐项检定。将鼓励申请者与CBER一起讨论，决定从分析检定到全面临床试验那些资料对制品对比是必需的。

7．审批的时间框架和提交申请的时间

申请者可能希望在提交PLA配套材料前提交中试设施的 ELA。所提交的申请材料应包括设施可供视察的声明。FDA原计划在申报许可证的产品投入生产时，对设施进行视察。在某些情况下，对生产设施的视察可能在提交PLA之前，提交ELA也可能在PLA之后。CBER按正常的复审时间审核不同时间提交的PLA和ELA，（从CBER接受日期起，标准申请12个月，优先申请6个月，补充申请6个月），CBER将根据审批结果，发出信函（已批准的，正在批准的或不批准的），以此结束其审批工作。

申请者应意识到，在不同时间提交ELA和PLA并不一定比同时申报更能缩短审批时间。然而，早些提交申请，可较早地从CBER得到反馈意见，因此申请者可更及时地进行修正。综上所述，CBER将同时批准PLA、ELA或其增补案。

   如产品的生产是由不同的厂家分担完成的，（见57 FR 55544 at 55545），应同时提交PLA的中间产品和最终产品材料，以便对产品进行全面的审核，因中间产品是决定其PLA最终产品是否得到批准的关键环节。可在不同的时间提交ELA和 PLA材料。

申请者应估价提交CBER申请材料时间的可能结果。在需要时，申请者可利用灵活的提交申报时间。申请者应认识到，如提交建档的材料是不成熟或不完全的，将使CBER和申请者造成不必要的资源浪费，因此，在取得理想的临床试验的初步数据或资料前，建议申请者不要提交ELA材料。当申报的制品是用于严重的和有生命威胁的疾病时，申请者应考虑同时提交ELA和PLA，以防止待批制品因设施尚未申报许可证而不能得到批准。

对于本指南未包含的内容，申请者应通过与适当的许可证申请部门联系，找到适宜的指南。联系部门包括：药品研究和审评办公室，血液研究和审评办公室，疫苗研究和审评办公室以及生产设施许可证办公室。

8．许可证审批过程中制品的限制性使用

如果申请者要求申请中试设施许可证，其审批过程可能影响制品的产量。用于治疗严重的和威胁生命的疾病的重要新制品，申请者应对其审批过程中制品的限制性使用的结果给予估价。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点

（ FDA，    CBER，    1994）

      前言

生物制品评价和研究中心（CBER）正在修订1987年的“人用单克隆抗体的生产和检定考虑要点（PTC）”。该最新修订本的目的是向开发单克隆抗体制品的发起人和研究人员提供帮助，包括研究性新药（IND）和产品许可证申请时应提交的资料。

此文件取代了1987年的文件，并反映了在多次国内、国际会议上讨论过的值得重视的经验，这些会议包括：

    1．FDA疫苗和相关生物制品咨委会于1990年8月召开的“生物制品潜在逆转录病毒污染”讨论会。

    2．由国际生物标准化学会（IABS）发起并于 1990年 11月在伦敦召开的“生物制品安全性的病毒学方面会议”。

    3．由FDA、IABS、NIH、国家疫苗规划办公室、HHS和WHO发起，于1991年3月在Bethesda召开的“传代细胞系当前所面临的问题”的国际性会议。

4．由FDA和NIH联合发起，于1992年1月在Bethesda召开的”单克隆抗体的临床前安全性试验工作会议”。

单克隆抗体和其他生物制品一样都有可供参考的法规（21 CFR部分200～299和600～680）。与CBER制定的其他考虑要点一样，单克隆抗体考虑要点亦不试图包容所有问题。当特殊制品产生特殊的未包括在“考虑要点”中的问题时，则应根据具体情况进行评估。本文及相应的法规本对生产和生产设施进行讨论，发起人应与治疗药物研究和评审办公室及生产企业许可证发放和产品监督办公室磋商。

某些单克隆抗体可由CDER负责主要审查工作，或由CDRH与CBER联合复审，各中心的管辖权依据1991年10月CBER和CDER及CBER和CDRH的内部协议执行。本考虑要点适合于按此协议联合复审的单克隆抗体。

    主档案

在研究性新药申请初始阶段不需要全部完成本文中讨论的所有资料，而应在临床开发阶段，由适当的中心以对话方式指导下，使资料不断完善。在某些情况下，在同一设施内以相同的方法制备及检定的单克隆抗体时，资料应归于单一主档案（Master File）中。一般说来，对提交IND主档案，企业或生产许可证申请中的生产数据、信息及所引用的文献均予保密。

    范围

用于活体外净化骨髓去除免疫或肿瘤细胞或与活体外净化骨髓装置相结合使用的单克隆抗体，用于收集细胞（如红细胞生成素干细胞）或纯化其他制品的单克隆抗体应与直接用于病人单克隆抗体的纯度、效力、安全性及无外源病毒污染标准相符合。另外，活体外骨髓处理（如补体）通常与单克隆抗体结合使用的试剂亦应符合同一直接用于患者的单克隆抗体标准。

    单克隆抗体的组合

CBER认为以有前途的临床前评估及临床理论为基础提出进行的联合单克隆抗体临床试验和许可证申请尚待讨论。目前预期有两种组合单克隆抗体类型：杂合型（cocktails和系列型（panels）。

在此文件中，cocktail定义为以固定比例混合而成的两种或多种单克隆抗体。相关的靶抗原包括位于传染性病原体上的多种抗原及多种肿瘤相关抗原。制品的组合理论应有清楚的临床环境或临床资料为依据。另外，应证明组合单克隆抗体间无干扰作用，并鉴定其协同或增强效应。有必要设定每种成份的剂量，剂量设定应根据临床前或临床资料证明某一剂量是必需量或是上限，以及组合物中单抗的比例而定。

在此文中所用 panelse的定义为直接抗相关抗原（如肿瘤抗原，HLA型抗原）的单克隆抗体系列，根据靶抗原的特性，可将其中一种或多种单抗用于单个患者。这些可按单一产品申请许可证。举例来说，单抗系列可以包括淋巴瘤的抗独特型单克隆抗体，及直接抗不同细菌或病毒血清型的单克隆抗体。必须设定每种成分的剂量。在证明全系列有效性的重要临床试验中，应首先获得系列中各成员某些临床经验资料。

制品的生产和检定

I．单克隆抗体的生产

目前，大多数单克隆抗体是抗体产生细胞与骨髓瘤细胞经化学诱导融合后获得的可无限传代的杂交瘤细胞系生产的。在某些情况下，杂交瘤与其他细胞系的再次融合会产生三重或四重杂交瘤。我们预料将来重组抗体及人抗体会有所增加。一般说来，下面所述的原则可适用于所有杂交瘤及异源杂交瘤产品，不考虑来源的种类。所有的生产程序应符合现行GMP标准。

    A．细胞系

    应提供下列材料

    1亲本（骨髓瘤）细胞系的来源，名称和特征，包括其合成及/或分泌的重链或轻链免疫球蛋白；

    2动物种类，品系，特性及免疫细胞的组织来源；

    3获得可无限传代细胞系程序的描述，如在建立细胞系时采用；

    4 免疫原的鉴定及特性；

    5．免疫方案的描述；对于人源单克隆抗体，无论是体外还是体内（如严重联合免疫缺陷（SCID）鼠模型）免疫程序均应描述；

    6．所用筛选程序的描述；对于人源单克隆抗体，应描述富集抗原特异性B细胞群所用步骤。

    7细胞克隆程序的描述（当细胞由含血清培养液适应无血清培养液时，应重新克隆）；

8建立及运用主细胞库及生产用细胞库所采用种子批系统的描述。

参照文献（1）。

    B．组织培养法制备

    应提供下列材料

    1组织培养程序的描述，如果制品完全在体外制备或细胞在接种小鼠前经过体外传代；

    2．所用培养液的描述，包括合格证明及检定结果（用于杂交瘤增殖的血清应无污染物及外源因子）；

    3．防止或控制病毒，细菌，真菌及支原体污染的措施；

4．用于进一步生产的细胞或组织培养上清的合格标准。

    C．腹水法制备

    1应提供有关接种细胞的资料（见B．1）。

2．动物的管理应符合NIH （有关实验动物的饲养与使用指南》，为保证获得生产单克隆抗体用稳定一致高质量的腹水，应建立起动物健康监控规划，包括检疫程序、前哨动物及内部卫生监测计划（包括支原体筛检）。我们亦建议使用无特定病原体（SPF）小鼠。应确定对前哨小鼠进行血清学检测的频率，通常根据病毒污染情况确定检测频率。

      3. 制备腹水的所有记录还应包括下列内容：

      a．所用动物的种属，性别及年龄；

  b．动物供应者；

  c．降植烷用量；

  d．接种细胞量及浓度；

  e．初次免疫、细胞接种及腹水采集的时间；

    f．腹水采集次数及方法；

    g．”批”的定义；

    h．动物垫料、饲料及水；

    i．同笼动物的数量；

3．各流程的环境条件。

    D．纯化

    单克隆抗体的纯化工艺应具备下列特征：

    1生产技术应能防止引入并可去除污染物；包括动物蛋白及材料、DNA、内毒素、其他热原质、培养液成分，层析柱析出成分及病毒等；

    2．纯化前测定病毒污染程度；

    3．应包括一个或一个以上已知可去除或灭活逆转录病毒的步骤（见参考文献2及第六章去除病毒验证的讨论）；

4纯化方法去除各种外源因子能力的验证。建议在验证试验中采用多种模拟病毒，包括大和小颗粒病毒，DNA和RNA基因组病毒，以及对化学敏感和有耐受性的类脂包膜和无包膜病毒株。这些试验应在实行最后生产工艺时进行。

    Ⅱ．纯化未修饰单克隆抗体的鉴定

单克隆抗体在用于人体试验前，应对其抗体特异性，结构完整性及效力等进行精确而全面的鉴定。单克隆抗体应尽可能无非免疫球蛋白污染物。应以一套适当的合格的内部参比品作为批间比较的标准。此套参比品应为己知结构、特异性及效力，在适当条件下保存，并定期检测其结构完整性。当产品改进时，参比品亦应相应改变，到Ⅲ期临床效力试验开始时应最终确定下来。

    A．结构完整性

应联合使用SDS－PAGE、IEF、HPLC或其他适当的理化方法证明纯化抗体未断裂。未聚合，末修饰（如：碳水化合物侧链缺失），应将生产批与内部参比品进行并列比较。

    B 特异性

试验应证明单克隆抗体与靶抗原特异结合。一旦抗体的特异性得到鉴定，则应用人的组织进行交叉反应性筛检（见第Ⅵ章）。

1．      1．  直接结合试验应包括阴、阳性抗体及抗原对照。至少应检测一种同型匹配但不相关的（阴性）对照抗体。阴性抗原对照应包括一种化学结构相似，但抗原性无关的复合物（如具有相似的化学性质、大小、电荷及电荷密度）。

    2．只要有可能，对蛋白，糖蛋白，脂多糖，或其他含有反应表位的分子进行生化测定，并测定自身的抗原表位，若抗原决定簇为碳水化合物，则应确定糖的组分、连接键及正位异构体构型。

    3．若有可能，应利用具有确定结构的抗原制品（如寡搪或肽），采用抑制法或其他技术鉴定抗体的特异性。对于复杂的生物混合物，对直接结合试验所用的被试抗原或抑制剂批应进行标化。应定量测定抗体结合被可溶性抗原或其他抗体抑制。

4．一旦确定某一抗体的特异性，重要的是定量测定抗体的结合活性，可以采用一切可行的方法，如亲和力测定，亲合性测定，免疫反应性测定或联合使用这些方法。目前已有许多已发表的方法适用于抗体结合活性的测定。

    C．抗独特型疫苗

    l．如果是抗独特型疫苗（Ab2疫苗），应鉴定Ab2免疫原，例如是传统型（Ab2 α）还是抗原模拟型（Ab2 β）（5a)。

    2．苦可以获得人 Abl抗体（名义抗原），则应证明 Ab2 β疫苗与适当的Abl群抗体具有反应性。

    3．应用远交系及近交系动物对Ab2制品免疫应答（对靶抗原）的适当性进行研究

    D．效力试验及标准规格

效力试验可用于鉴定产品，监测批间变异和确保产品的稳定性。可通过结合试验，血清学试验，在动物模型中的活性试验，体内或体外功能试验进行效力测定。最理想的情况是，试验方法与制品公认的生理活性具有最相近的关系，并有足够的敏感性，以检测出制品临床功能差异。由于效力试验用于保证制品批间一致性，因此效力试验应可靠，可重复并敏感。

    1．抗体结合活性可用ELISA，RIA，放免沉淀反应，细胞毒性反应，流式血细胞计数或其他适宜标准方法定量测定。活性应以每mg抗体的特异性抗原结合活性表示。产品应与内部参比品对比，若已建立起适当的抗体亲和力测定方法，则该方法将有助于其他试验。在计算效力时应采用平行线性生物测定法或类似的有效统计方法。

    2．单克隆抗体的效力亦可用测定动物模型测定活体内功能的方法测定，尽管该法常常较繁琐且难以标准化。当体内及体外测定抗体活性相关时，动物模型有助于验证体外效力测定方法。

    3．在效力试验中，充分反映制品生物学活性的允许值范围应以特定抗体的经验为依据。较理想的是，临床结果应与效力试验相关，以发展有意义的替代的体外效力测定法。这意味着应在临床开发阶段使用大批制品。

Ⅲ．与毒素、药物、放射性核素或其他试剂偶联单克隆抗体的特殊考虑

除对先前讨论的有关末偶联单克隆抗体（裸露单克隆抗体）的建议外，免疫结合物的生产厂家应注意下列内容：

    A．免疫结合物的构建

    应提供构建免疫结合物所用试剂的详细资料，包括：

    1．单克隆抗体部分的同种型，结构，纯度及结合特异性；

    2，描述与单克隆抗体连接的成分如：毒素，药物．酶及细胞因子，包括：

    a．所有成分的来源，结构，制法，纯度（包括证明无外源因子）及特征（若所用成分是购进的，应提供厂家的分析证书）。每种成分的毒性描述应充分说明可能出现不良作用的发生率及严重性；

b．来源于传代细胞或用遗传工程方法制备的产品［（如转染瘤；细菌合成的，嵌合的，易形的，互补决定区（cdr）接合的及单链Fv抗体；以及重组免疫毒素等］应符合参考文献（1），（17）和（18）中所提出的建议。

    3．制备免疫结合物所用化学试剂的描述，如连接剂和螫合剂。这些资料应该包括试剂来源，制备方法，以及合成或纯化时残留杂质的测定等内容。还应提供合成反应途径的图解，以及与免疫结合物制备中所用化学试剂毒性有关的已公开发表或内部相关资料。活性中间体应被灭活或去除。

    B．免疫结合物的纯度

    1．应采取特殊措施保证抗体制品尽可能无外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染物，因这些物质在构建免疫结合物过程中，能与核素，毒素或药物发生反应。

    2．应规定最终产品中游离抗体或游离组分的限量，并进行测定。

    3．为建立成品批签发标准及探索免疫球蛋白置换数量，效力及稳定性间关系，首先应测定偶联物与抗体的平均比率及每个抗体被结合部分的数量及结合位置。

    C．免疫结合物的免疫反应性，效力及稳定性

    毒素或药物偶联至抗体上会改变其中任一成分的活性。

    1．应采用适当的方法评估偶联前后的免疫反应性（3，4）。

    2．除放射造影能力以外应评估免疫结合物的效力。

    3．免疫结合物构建后，应确定免疫反应性变化的百分率限值，并作为产品规格的组成部分。

    4．应检测免疫结合物的体外稳定性，将免疫结合物在合并的人血清中37℃孵育至少2个人用产品的半衰期，经过规定间隔时间分析等分样品中完整免疫结合物及分解产物的浓度。应详细说明评估产品稳定性的条件及所用的阴、阳性对照。

    5．应检测免疫结合物的体内稳定性

    a．在用动物进行药物动力学及组织分布试验中，应测定某一免疫结合物的单个成分，并与未修饰单克隆抗体的组织分布进行比较。

b．应证明各种成分的靶组织及可能引起的潜在毒性。

D．与放射性核素偶联单克隆抗体的特殊问题

    1．放免结合物应用标准化的、严格控制并经过验证的方法制备。应建立检测游离同位素、结合单克隆抗体、标记的非免疫球蛋白物质的放射性百分率的方法。

    a．建议，放射性标记单克隆抗体的初始研究用新药申报包含2～3次放射标记试生产的分析结果，应证明所制备的产品具有免疫反应性，无菌，无热原质。此项工作应由将使用这种试剂进行研究工作的同一人员来做。

    b．制备免疫结合物时应使用放射药物级同位素。药物主档案中应有提交的每种同位素无菌及无热原质的分析证书及横向参比的信函。

    C．在标记试生产过程中，应测定最终产品中共价结合的和游离的同位素的浓度，以及标记试剂及其分解产物的残留水平。

d．应描述给每一个病人应用前后进行的质控试验。

    2．动物试验

    a．动物的生物分布资料可用于I期临床前人用剂量的估定。

    b．表达靶抗原的动物模型更可能揭示抗原沉积点或非预期抗原表达的组织。

    C．异源移植模型可以评估组织靶位和抗原非特异性放射免疫结合物的分布问题．但无助于鉴定无关正常抗原的表达或组织交叉反应性的分布。

    d．应对足量的动物进行研究以获得具有可接受的变异系数（通常小于20％）的放射性剂量估算。

    e．应对所用的放免活性和充分的时间点进行全过程计量，以确定放免试剂早期及晚期清除期。

f．应用将放免结合物置血清中培育的方法测定其体外稳定性（参见第Ⅲ章C．4）。应建立起估测游离同位素、结合单克隆抗体及标记的非免疫球蛋白物质的各自放免活性百分率的方法。

    IV．质量控制及产品检定

    A．细胞系鉴定

若单克隆抗体用作生物治疗用制剂，生产单抗用的细胞系的鉴定，应按表1文献（1）中所述试验方法，对主细胞库（MCB和生产用细胞库（MWCB）分别筛检一次，包括内源及外源因子。常规电镜检查有助于检出细胞系中潜在高水平的病毒污染。因MWCB来源于MCB，且只是经过了几次组织培养传代，因此，采用新引入污染物的简化检查法是可行的。任何病毒污染都应进行鉴定并定量，以确定纯化过程应达到的清除病毒指标。若纯化过程发生改变，厂家应该重新评估病毒污染程度并重新验证的。应采用适当的感染试验确定每种病毒对人细胞的亲嗜性。如采用组织培养或发酵生产，应检测生产终末细胞（EPC），以评估新的污染物是引入或是生长环境滋生的作出评估。当培养基或生产规模发生变化时，应重新检测EPC。

            表1细胞系鉴定检测试验

试验          MCB          MWCB            EPC

无菌试验       +             +               +

支原体检查     +             +               +

病毒检查

  常规         +             +               +

  种特异病毒*  +             -               +

  逆转录病毒** +             -               +

可靠性检测     +             +               +

*：检查啮齿类；灵长类或人的病毒（不包括逆转录病毒）等。

**：除鼠源杂交瘤外，所有其他的细胞基质均应检查逆转录病毒。

  1．应通过无菌试验证明细胞系无细菌及真菌污染。推荐的支原体（可培养的和不可培养的）检查方法参见参考文献1。

  2外源病毒检查应包括文献1所述的常规的体内及体外试验。

  3．种特异病毒检查(非逆转录病毒）：

    a．小鼠细胞系（见附录2）应采用小鼠抗体产生（MAP）试验法，地鼠细胞系采用地鼠抗体产生（HAP）试验法，大鼠细胞系采用大鼠抗体产生（RAP）试验法。对于淋巴细胞绒性脉络膜脑膜炎病毒（LCM）包括非致死株，推荐进行体内试验。HAP试验应包括小鼠的微小病毒（见第Ⅲ章B．1．C）。

    b．污染过LCM、呼肠孤病毒、轮状病毒、仙台病毒或汉坦病毒的原料不应用于单克隆抗体生产。

    C．猴细胞系应进行下列病毒的检查：疮疹病毒（狼疱疹及SA－8）、巨细胞病毒（sCMV）、脑心肌炎病毒、猴出血热病毒（SHF）、猴水痘病毒（sVZV）、腺病毒、SV－40、猴痘病毒、麻疹病毒及Ebola病毒。

    d．人细胞系应进行下列病毒的检查：EB病毒、巨细胞病毒（CMV)、乙肝（HBV)及丙肝（HCV）病毒、人疱疹病毒6型（HHV－6）以及由细胞供者病史或建立原代细胞系所用组织类型提示的其他任何病毒。

e．其他种类细胞系的检查请向CBER咨询。

    4．细胞系的逆转录病毒检查：来源于不同种类的细胞污染逆转录病毒有所不同，在设计逆转录病毒检查时，应考虑以下各点：

    a．应考虑到制备单克隆抗体所用的鼠源细胞本身有的能够产生有传染性的鼠源逆转录病毒。因此，不必再证实小鼠逆转录病毒的存在。但是，应按收获物的系列测定原材料的逆转录病毒量，并证明各批之间均衡一致（1）。应通过试验证明纯化工艺能有效去除逆转录病毒（亦见第IV章D）。

    b．大鼠骨髓瘤细胞系及其杂交瘤可能不表达逆转录病毒（6）。因此，应将检测样品与一种对广谱逆转录病毒敏感的细胞系共同培养；并与敏感检测试验方法相结合，证明不存在逆转录病毒，包括检查EPC及若干批产品。若感染性试验或电镜均未检查出逆转录病毒，则不必进行进一步的验证。由大鼠细胞系制备单克隆抗体的纯化工艺要求包含一个或一个以上灭活或去除逆转录病毒的步骤。

    C．地鼠细胞系表达缺陷型逆转录病毒颗粒（7）。该细胞是否能够表达感染性逆转录病毒尚不可知。发起人应用现有最敏感的感染性试验证明不存在感染性地鼠逆转录病毒，包括待检样品与广谱逆转录病毒易感细胞系共同培养，并与敏感检测方法相结合。当制品进入Ⅱ期临床和关键性临床试验阶段，则有必要利用广谱指示性细胞（包括人细胞系（8，9））进一步检查潜在感染性病毒。由于检查地鼠逆转录病毒感染性试验的有效性尚未确定，故应通过试验证实纯化工艺能充分去除逆转录病毒颗粒（见第Ⅳ章）。

    d．猴细胞系应检测SIV、STLV、SRV、FV和HIV及HTLV。

e．人细胞系应检测 HIV-1，2、HTLV、SIV、STLV及 FV。

    5．确认试验应证实细胞系的物种来源、典型特征，并证明无细胞系交叉污染。

    B．原材料、纯化半成品及成品批的质控及标准规格

    应对每一批产品进行质量监控[21(FR600，3（x）］，该要求同样适用于末加工材料及纯化材料。

                          表2每批产品的安全性试验

                      试验         原材料      半成品     成品

                  无菌试验           ＋          ＋         ＋

                支原体检查           ＋          —         一

                  病毒检查

                   常规＊           十          —         —

                  种特异病毒＊＊     ＋          —         一

                  逆转录病毒。＊＊   十          —         —

                  多核苷酸           一          十         —

                  一般安全性试验     —          一         ＋

                  内毒素             —          －         ＋

                      ＊：对于非腹水原料，应进行含有三种指示细胞的体外常规试验，                体内试验通常只做一次，但若生产方法改变，则需重复检查

    ＊＊： MAP RAP和HAP试验仅用于检查腹水原料。

    ＊＊＊：逆转录病毒的定量[感染试验或电镜检查（TEM）］对鼠源杂交瘤很重要；而对于其他杂交瘤，若MCB或EPC为阳性；则进行TEM、RT DNA杂交及共同培养试验很重要。

    1．原材料

    a. 收获的组织培养液应无细菌污染。若无菌试验证明所收获的合并腹水中存在活的污染物，则应进行定量，并根据生产经验规定细菌污染的允许范围。应定期鉴定污染细菌的种类。当污染量反复超过允许范围时，也应鉴定细菌种类。建议在贮存前收获的腹水用经 0.45 μm的滤膜过滤（亦见第 Ⅸ章B，1．b）。

b．末纯化的杂交瘤上清在澄清过滤前应进行可培养的及不可培养的支原体检查（l）。末加工腹水在进行支原体检查前经 0.45μm滤膜过滤；随后贮存于≤-60℃，同时，以同样方式处理已知抗体滴度的阳性对照，若阳性对照的抗体滴度下降小于10倍，则这种处理腹水的方法是允许的。若动物群或末纯化腹水或杂交瘤上清中检查出支原体污染物，则这些材料不应使用，或进一步加工。

c应常规用三种指示细胞系进行体外病毒检查，体内试验通常只做一次（作为细胞系鉴定的一部分，见第IV章A），但是当生产方法改变时，则应重新进行（1）。含地鼠细胞的生物反应罐会被常规体外试验漏检的小鼠微小病毒污染，用MAP试验检查此病毒较为敏感。总的来说，连续生产而不是单批生产时，应根据实际经验规定调整监测频率。当某一生产设施污染了某一特定病毒时，应考虑修改常规检查计划，以便检出该病毒。

d．应进行种特异病毒检查（见第Ⅲ章A.3）。

e．收获的腹水应进行小鼠逆转录病毒污染物常规定量检查。应对若干批组织培养物进行逆转录病毒污染定量检查，以确定特定细胞系及生产过程的病毒污染水平（l）（见第IV章D）。为检查非小鼠逆转录病毒，应用能支持广范围逆转录病毒[包括人及非人灵长类的病毒（l）］生长的试验细胞系检查原材料。

f．若用不同组小鼠制备腹水，则在用其生产腹水前，对每一组小鼠应重复进行种特异病毒的血清学监测。

    2纯化半成品

末修饰及修饰单克隆抗体纯化半成品的常规检定应包括下列检定（免疫结合物的讨论见第Ⅷ章）：

    a．化学纯度包括外源动物蛋白的残留量，如成品中的白蛋白，免疫球蛋白或其他污染物。应在还原及非还原处理条件下，用考马斯亮蓝染色和银染方法对递增量纯化物进行SDS－PAGE分析。只要可能，应以检出灵敏度为1ppm（相对于单克隆抗体重量）的方法检测，将污染控制在可检出水平以下；

b．分子完整性：包括是否含有聚合、变性或断裂产物；

c．免疫球蛋白的类及亚类；

d．可与内部参考品标准相比的每批半成品单克隆抗体（或其重链或轻链）的IEF图谱；

e．无菌试验；

f．在检查细胞库细胞（见第Ⅲ章A）中，若检出传染因子，应验证单克隆抗体纯化工艺将其去除的效果。应对最初连续的3～5批纯化半成品进行检查，以证实纯化工艺已去除污染物。若在细胞库细胞中检出人的感染因子，则每批纯化制品应进行检测，并建议在扩大生产前，向CBER人员咨询；

g．在加赋形剂前，建议对每批产品进行DNA含量检定，如果可能，成品中细胞DNA含量应不超过100pg／剂量。

h．潜在污染物或添加剂（如抗生素、试剂、防腐剂或亲合柱析出成分如蛋白A）的检测及定量试验。应无青霉素或其他β内酸胺类抗生素。用标准方法不能去除的痕量污染物，在提出IND申请前，可接受值应与CBER讨论。若在腹水制备中使用了降植烷，则应证明用敏感方法检测不出来。

    3．分装的成品

应对每批分装成品进行下列检定（21CFR，600，3（y））。在某些特定情况下（如放射性标记用），应就成品检定的特殊事宜与CBER讨论，并依情况而定。

    a．蛋白浓度；

    b．效力（21 CFR 610.10）；

    C在还原及非还原条件下，产品在聚丙烯酰胺电泳中的移行，与内部参考标准对比进行。

    d．无菌试验（21 CFR 610，12）；

    e．一般安全试验（21，CFR 610．11）；

    f内毒素测定：如鲎试剂试验（LAL）用21CFR 610．13中所述的家兔热原试验验证过，可认为是一种可行的等同检定方法（ 21 CFR 610.9）。应用美国批准的试验系统进行LAL试验。若所用的LAL源于不同厂家，则应重复比较性试验。家兔热原与LAL检测程序比较试验的必要条件应根据实际情况讨论确定。亦请参见文献（11）。

    g.适当的鉴别试验（21 CFR 610．14）；

    h．水分（21 CFR 610．13）测定；

    i．防腐剂（21 CFR 610．15）测定。

    C．产品稳定性

产品稳定性应满足临床方案制定的要求。快速的稳定性试验资料可作为产品审批及标定的辅助材料，但不能代替实时资料。

    1．应制定稳定性检定规划，包括在规定效期全过程中，每间隔一定时间进行制品的化学完整性试验（如断裂或聚合）及效力试验。亦参见文献（11b）。若临床试验的制品，在贮存期间发生显著变化，应向CBER报告。如申请产品生产许可证，最好在研究的每一阶段前，用销售时用的容器和封盖分装的成品进行支持效期的稳定性试验。

    2．确保制品生物活性的稳定性试验应包括厂内参比品。只要可能在试验的全过程中只使用一批试验抗原（如：纯化的抗原、细胞或组织）。定量试验应用于比较效力所界定的生物活性。

    3．快速稳定性试验有助于鉴定及建立稳定性指示试验，重要的参数是对每一批制品用趋向分析方法进行指示稳定性监测。

    D．某一已知污染物的定量及去除

应估测原料中污染物含量，例如：末纯化的单克隆抗体经常污染小鼠逆转录病毒。若污染物为病毒，则应探讨对人细胞的任何可能或可疑亲嗜性（如通过共同培养法），然后，在模拟纯化系统中，利用污染物自身或已知污染物的典型相似物（如逆转录病毒模型）证明纯化工艺会除污染物的效果（1）。

除低速离心澄清外，在进行任何其他加工之前，应先对未纯化的浓缩上清液或腹水进行检查。我们建议，对用啮齿动物细胞系生产的污染逆转录病毒的腹水或上清，应用浓缩样品以电镜检查法定量。若TEM法检出病毒颗粒，应假定其具有感染性，以便制定去除逆转录病毒的指标。若TEM结果为阴性，就假定逆转录病毒的效价为 1×106/ml。由非啮齿动物或杂交瘤细胞制备的腹水或上清不仅应用 TEM检查，而且还应用灵敏、现代水平的感染性试验检测，此类试验可检出由细胞基质产生的所有已知类型的逆转录病毒。

验证纯化工艺去除或灭活逆转病毒的效果是最重要要求。参考文献1和2亦讨论了去除逆转录病毒验证试验设计，该试验的目的在于证明与初期污染相比，纯化工艺使病毒量最低限度减少了3 log，第V章提供了验证Ⅰ期单抗临床去除咽齿动物逆转录病毒的简化方法。应在制品开发的初期，与CBER讨论去除或灭活病毒工序的设计及验证。

V．某些Ⅰ期临床用单抗的简化验证程序

只在就去除病毒程序选择向CBER人员咨询后，实施简化的验证方法。

    A．一般考虑

以下程序可代替目前的大规模生产技术证明在下列特定条件下啮齿动物逆转录病毒的充分去除。尽管简化验证程序在逆转录病毒污染物的检测及鉴定方面不如大规模生产中所采用的全面，但对原料中逆转录病毒的含量测定及证明病毒的去除仍是简化程序的关键环节。

    1．简化验证程序适用于以啮齿动物细胞，无论是腹水或组织培养制备的单抗，但不适用于用其他细胞基质制备的单抗。

2简化验证程序仅用于临床适应症为患者生命直接受到威胁或严重衰弱性疾病（主要发病），且无治疗方法或当前治疗手段不理想时。 21CFR 34．生命直接受到威胁疾病的定义为：在几个月内可能将会发生死亡或因无早期治疗造成过早死亡的疾病过程。

    3．如本文前文及文献（1）所述，关于外源因子检查的建议不应简化。

4．简化验证程序不能用于支持Ⅰ期临床以后的试验；也不能用于支持以正常人或大量人群为对象的试验。

B．用简化验证程序证明逆转录病毒的去除

    1．一般考虑

    a．原料中逆转录病毒的滴度（见第IV章D）应用于指导和量化任一纯化过程。

b．建议所有的纯化工艺应包括一个或一个以上强化的去除或灭活病毒工序。强化工序定义为在不同条件下（如柱层析缓冲液pH或离子强度），对多种单抗均有效。强化工序包括低pH，加热，溶媒或去污剂处理，过滤。可用下列方法证明强化方法去除病毒的有效性：a)模拟系统（同属验证）；b）与替代抗体（通常源于同种及同种型）去除病毒程序相比较，两种方法由同一发起人完成；c）用单克隆抗体产品自身去除逆转录病毒。

C. 亲和及离子交换层析，以及去污剂处理不认为是强化方法。以上处理方法应用单克隆抗体制品本身，或由同一人员用另一单克隆抗体对比进行纯化和去除逆转录病毒的方法进行验证。单克隆抗体制品及替代单克隆抗体的结果应符合B．3项应用法则系统项下的相似性规则。

    2．同属验证

同属验证是一种适用于各群及各类别分子的病毒灭活或去除的综合方案。这些方法在主文件中能横向参比。适当的已发表的资料应只包括高质量及被广泛承认的科学研究结果。若CBER判定某项资料符合科学质量的高标准，则以发起人或其他实验室提供的资料为依据建立的尚未发表的病毒去除方法是同样可接受的。

    3．应用法则系统

    a．同属病毒去除验证程序中所用的替代单克隆抗体应与Ig单克隆抗体制品在类/同种型／种（如lgG-lgM）、电荷及其他主要的生化特征方面相一致。一般说来，替代单克隆抗体与制品抗体为同种同源（即均源于腹水或杂交瘤／转染瘤上清）。

b．同属病毒去除系统中所用的去除及灭活病毒步骤若与纯化单克隆抗体所用的方法不同，则应与其相类似。在所有病毒灭活及去除步骤中，应特别注意层析柱洗脱缓冲液条件，包括pH和离子强度、过柱顺序、蛋白浓度、保留时间、压力条件、湿度及与伴随规模扩大出现的潜在问题。纯化及病毒去除步骤的相似性应以发起人产品验证实验室提供的资料为依据。

    4。其他考虑事项

    a．当制品进入扩大Ⅰ期或Ⅱ期临床阶段，应提供证明逆转录病毒被充分去除（见第 Ⅵ章D）的全面的或完整的验证资料。资料不仅要通过在模拟纯化中用现实抗体制品证明单克隆抗体纯化程序自身可去除已知的或高度可疑的病毒污染物，同时应证明每一步骤去除或灭活病毒的作用。

b．采用简化验证程序生产的单克隆抗体Ⅰ期临床被试人同意文件，要准确反映出鼠源逆转录病毒偶然感染人的潜在危险。

C．由于担心鼠源和人源逆转录病毒基因序列间潜在的相互作用，简化验证程序不适用于预定给已知逆转录病毒感染（如 HIV-1，2;HTLV－1，2)患者用的抗体。此程序亦不适用于预定给患有实质性细胞免疫缺陷病人用的抗体。

d．表3列出了采用各种强化的或非强化的灭活／去除步骤预测的逆转录病毒的去除范围（以 log表示），其目的在于帮助生产者设计单克隆抗体的纯化工艺。任何特定步骤去除逆转录病毒的效果取决于多种因素，因此应根据实际经验并考虑这些因素。

                          表3(2)

  灭活步骤             强化步骤             报导去除病毒log

  pH3～4．5                是                   3－4

  加热                     是                    4

  溶媒／去污剂             是                    5

  过滤（0．02～0.04μm）   是                   4－8

  去污剂                  不是                   4

  亲和／离子交换          不是                  1－5

Ⅵ．与生产改变有关的问题（证明产品相当性）

    A．临床试验期间生产的改变

在单克隆抗体临床开发期间，制品生产工艺经常改变。发起人应预先考虑这些改变并制定一份计划证明新、旧工艺生产的产品是相当的，尤其是在生产改变前已取得支持深入的临床试验及市场销售权申请的临床前或临床资料时。证明产品相当性的计划应及时提交CBER审批。

只要生产中发生改变，应对单克隆抗体进行严格的体外生化及功能特性鉴定（见第Ⅰ章产品生产及检定）。根据体外试验及动物试验类型和资料质量，可能不必用扩大临床资料证明产品的相当性。但在某些情况下，对两种不同生产工艺下的产品进行扩大对比临床评估的必要性增大。这些情况包括：

    1．不能用分析试验充分鉴定产品的活性。

    2．生化试验证明产品间存在差异。

    3．动物试验揭示产品间存在药物动力学或其他方面的差异。

在早期临床开发期间生产发生变化时，正在进行的临床试验应包括临床相当性试验，如生产变化发生于临床试验晚期（2／3期），如果产品的生化及功能特性分析表明新旧产品有差异，则可能需要补充进行临床评价。这些临床试验的设计及范围将取决于所提出的问题。例如，提出的问题是修改清除率，则可能只需进行比较性药物动力学试验。在所有的情况下，用预定患者人群进行对比试验应有适当的设计方案，包括充分的统计方法，以解决特定问题（12）。许多周密计划的试验都可纳入单克隆抗体的全面药物开发项目中。

    B．产品批准后的生产改变

当细胞库或已上市产品的生产显著改变时，厂家应提交产品许可证修正件，包括提供保证在产品标签上说明产品系用新工艺制备的资料。通常仅需对新、旧工序生产的单克隆抗体进行生化及功能特性分析，重新进行外源因子检定及病毒去除的验证。在其他情况下（如上述A．1-3）还需进行比较性临床试验（12）。发起人应根据生化及动物试验结果及统计结果制定推荐的试验计划，并提交CBER以备复审的征求意见。

                       临床前试验

    Ⅶ．交叉反应性试验

当相同或相关抗原决定簇在人的细胞或非预定的靶组织表达，可观察到抗体与这种组织的结合。交叉反应性具有严重后果，特别是使用药理活性抗体或细胞毒性免疫结合物时。因此，一般在Ⅰ期；临床试验前应经常进行交叉反应性的实验室检测。对于双特异性抗体，除检测双特异性产品外，还应对每株母本抗体进行逐个评估。

    A体外试验

    目前，人细胞或组织是用免疫细胞化学及免疫组织化学技术进行检测的，若可能，最好用较新的技术检测，

    1．应用附录1中所列速冻成人组织测定抗体或免疫结合物的反应性，最好是外科手术样本，也允许采用组织保存良好的尸检样本。因检测存在多形性，至少应对王个无相互关系供者的组织进行评估，应以已知阳性组织评估固定液的影响，以保证在组织处理过程中靶抗原得到保护。

    2．在特殊情形下，可以通过检测有代表性的培养细胞系、干细胞及胚／胎儿组织来测定交叉反应性。

    3．应测定若干种浓度的制品，交叉反应的检测能力可能取决于抗体浓度，当选择适当的浓度进行组织结合研究时，应考虑到抗体的亲和力以及预期能达到的最大血浆浓度，也应尽可能比较单克隆抗体与靶组织及与交叉反应组织结合的比率。由于可能观察到非特异性结合现象，有可能时，应用纯化抗原进行抑制试验评估潜在交叉反应的特异性。

4．为阐述试验结果，必需有阳性及阴性对照，对照证实了组织的可用条件及方法能否满足要求。因转铁蛋白是正常和肿瘤细胞表面一种普通而又大量存在的分子，可以用抗转铁蛋白受体单克隆抗体作为阳性对照。

5．若临床使用衍生的抗体或抗体片段，应就所用类型进行检测。不要用与被检单抗有相似特异性的替代抗体进行交叉反应性测定。

6．当还有交叉反应且靶抗原可能存在多形性时，则试验应扩大到较大系列组织，以确定其频率。

7．比较来源于不同种类动物组织的体外交叉反应性，对于确定最相关的毒性试验动物具有重要意义。

    B体内试验

综合体内试验应显示某单克隆抗体与非靶人组织的交叉反应性，首先在动物体内，然后在人体内进行。对于溶细胞性免疫结合物或具ADCC活性抗体的研究，通常要求进行较详细的临床前试验，包括用一种以上动物及重复剂量进行动物试验。

    Ⅷ. 临床前药理学、安全性和毒性试验

单克隆抗体临床前安全试验的目的在于鉴定及估量可能出现的人体不良反应发生率及严重程度，如可能，并确定安全的起始剂量及逐步提高的剂量。单克隆抗体制品临床前试验内容包括其免疫原性、稳定性、组织交叉反应性和有效性。动物种类的差异会使临床前试验的设计及解释复杂化。

    A．一般考虑

    1．生产或产品配制的改变可导致生物活性重大变化。因此建议，临床前试验用材料应与临床试验用产品批的制备程序相同。在某些情况下，可适当修改临床前试验的载体系统的成分，用同源动物血清白蛋白代替人血清白蛋白作为载体，可防止在动物体内形成抗-白蛋白抗体，因而增加了临床前试验的有效性。

    2．临床前试验方案应尽最大可能与建议的临床使用剂量浓度、时间表、途径及次数相同。剂量范围选择应至少包括两个剂量，一个为等效剂量，另一个为最高预期的临床剂量。进行安全性试验时，应对大范围的使用剂量进行测试，以保证最高剂量的体内分布及清除差异不会产生不良作用。对于毒性试验，所检测的最高剂量应显示不良作用，应建立以三个剂量为最低值的最佳剂量范围。通过对几种剂量及用药间隔的试验确定剂量反应曲线的线性关系及总体状态。

    B．动物安全性试验

    当准备进行单克隆抗体的毒性试验时，应考虑下列因素：

    1．若被试样品为无修饰抗体，且无疾病活性的动物模型或无携带相关抗原的动物，且与人组织交叉反应性试验阴性，则检测项目可以限于“一般安全性试验”所述内容（21 CFR 610．11）。

2 若有动物模型，则应尽可能证明生物学效应的剂量依赖性，使用较高剂量可以较好地预测治疗指数。

3 体内活性模型在提供使用推荐产品的理论说明并确定安全性和毒性方面已证明是有意义的。例如，异源移植模型可用于评估抗体与人肿瘤细胞的结合力。动物疾病模型则能研究单克隆抗体在许多炎症反应，自身免疫性疾病及异体移植排斥等方面的作用。

4 动物体内相关抗原的性质与人体内相关抗原的生物学分布、功能及结构应具有可比性。例如：可以在狒狒体内研究CD34+前体细胞，因狒狒及人体内相同的细胞组分均表达CD34+抗原，并产生造血细胞。但是，对于所用的动物模型，不必要求单克隆抗体的抗原密度或亲和力绝对相等。例如，结合力差异可通过增加剂量或服药次数来弥补。应定量鉴定动物和人之间在抗原数、单克隆抗体的抗原亲和力或对单克隆抗体结合的细胞应答反应等方面存在的差异，这可以更精确的推断人用的安全初始剂量，并评估安全性极限。

5 由于免疫结合物可能被降解或作用位点的活性不是单克隆抗体与靶抗原结合的结果，应对含有放射性核素、毒素或药物的免疫结合物进行动物毒性试验。试验应包括每一种免疫结合物组分，包括游离毒素、药物或核素在内的毒性及靶器官，所得结果应与结合物稳定性试验密切相关。只要可能，应用具有相关靶抗原或疾病模型动物体内进行免疫结合物试验。游离毒素或核素的毒性试验应用不同种类动物进行。

6．对单克隆抗体通常不要求进行常规突变性评估。

    C．药物动力学/生物学分布

药物动力学模型有助于阐明临床前活性及毒性，有助于推荐适当的剂量范围，进而可以改进临床试验的设计方案。这种研究的目的在于测定药物动力学及药效学的终点。生物分布的研究可以提供单克隆抗体结合非目的组织的初始证据，或解释在动物体内所观察到的毒性。资料的阐述应考虑单克隆抗体的物种来源、同种型、单克隆抗体是否是完整的免疫球蛋白或碎片、抗体标记方法、免疫结合物的稳定性、在受者体内抗原表达的水平、与血清蛋白的结合及使用途径等。糖基化、对蛋白酶的感受性、循环抗原的存在及宿主免疫应答亦影响单克隆抗体的半衰期，抗制品抗体的存在会改变其生物学分布、代谢及清除。

    1．下列方面可以指导试验动物种类的选择：

    a．最好选择与人有交叉反应或相同靶抗原的动物种类模型来试验单抗。对于抗人抗原的无修饰单克隆抗体，同抗外源抗原（细菌、病毒等）的单克隆抗体一样，若不是为了解决生产问题（见第Ⅵ章产品均一性），可以不必在缺乏靶抗原的动物种类中试验。

b．当有抗原结合资料表明灵长类为最相关物种时，则对未偶联的单克隆抗体的试验采用非人灵长类动物是适宜的。

C．应对使用正常啮齿类动物和鼠异源移植模型精确预测单克隆抗体的人药物动力学行为的可能性进行严格评估。异源移植模型对评估单克隆抗体与人体内肿瘤结合的能力更有意义。

    2．应通过一种以上方法（如应用ELISA法和放射活性测定的方法检测放射性标记的单克隆抗体）确定药物动力学参数。对于任何类的免疫结合物，完整的结合物应与游离单克隆抗体及游离配基相区别（如毒素、药物或放射性核）。

    3．抗免疫球蛋白抗体的出现使分析及解释动物体内的重复剂量效应大大地复杂化，鼠源抗体对于小鼠为非免疫原性物质，但在人体内具免疫原性，这就使得在鼠内所得的重复剂量结果难以外推至拟在人体内使用的重复剂量。使用人的或人源化的单克隆抗体将出现相反的问题，在这种情况下用啮齿类动物进行重复剂量的研究意义不大。

4．在产品开发过程中生产过程发生改变时（见第Ⅵ章有关产品相当性），可以通过药物动力学或药效学的研究说明产品的相当性。用于测定产品相当性的药物动力学参数包括Tmax、Cmax及AUC，这些数据可通过在适当种类动物中进行的产品-时间活性曲线计算而得。

                            临床试验

人用单克隆抗体通常具有良好的耐受性。因为单克隆抗体与特异性抗原的非目的性结合引起严重或致死性的副作用的实例很少见。由于这类罕见情况的发生，突出了单克隆抗体组织交叉反应性检测的重要性，尤其是在不能获得相关抗原动物模型时，以便提醒医生注意潜在的毒性并采用较保守的剂量方案。

Ⅸ．Ⅰ期临床试验的一般设计

      A目的

      Ⅰ期临床试验应进行下列工作：（a）确定一般毒性；（b)找出剂量与毒性间的关系；  （c）测定制品在人体内的药物动力学行为；（d）收集免疫原性资料；并在某些情况下（e）探索单克隆抗体活性的初步证据及其与剂量的关系。

应该认识到，带有FC部分的抗体很可能会产生抗体特异性副作用，因Fc部分能够激活补体或诱导ADCC效应（即人IgG1和IgG3，小鼠IgG2a）而导致结合细胞的溶解。单克隆抗体亦可通过阻断或诱导靶细胞功能产生预期的或相反的作用（如用抗CD3单克隆抗体诱发T-细胞受体后会产生淋巴因子释放综合症）。

单克隆抗体分别属于几个较广的类别，其中每一种的Ⅰ期临床试验所用的方法会略有不同。对于治疗用的非偶联的单克隆抗体，可能没必要或不可能一直分析到最大耐受剂量值（MTD）或剂量限制毒性值（DLT）。相反，通过测定抗原结合或饱和或达到预期生物学效应的程度确定最佳的生物学剂量（OBD）可能是更适宜的作法。当免疫激活的与单克隆抗体作用或毒性机理有关时，应评估单克隆抗体的免疫激活作用。而对于放射性标记的治疗用单克隆抗体或免疫毒素，应主要考虑他们与非预期的组织结合或结合物提前释放等问题。对接受免疫毒素治疗的病人应进行毛细血管渗漏综合症及肝、肾和肌肉损伤的监测。

    B．被试人群

    1．一般说来，单克隆抗体临床试验的对象应为最终接受该产品治疗的有代表性的人群。目前研究的大多数单克隆抗体有潜在的免疫原性，且缺乏用有靶抗原的健康动物或动物疾病模型获得的详细毒性资料，通常健康志愿者不适于作为Ⅰ期临床试验的对象。当考虑用健康志愿者作单克隆抗体的初期试验对象时，被试对象同意文件应反映应出此项工作无直接的医学效益且存在因接受异源蛋白而产生的潜在的、即时的或长期的危险。这些危险包括：可能存在的毒性、变态反应，以及由于免疫应答（即人抗鼠抗体或HAMA；注意：在整篇讨论过程中所用的术语“HAMA”是指抗任何外源免疫球蛋白的抗体。）而将来不能接受诊断及治疗用单克隆抗体。在Ⅰ期试验中，可在下列情况下采用健康自愿人员：

a．当某一新试剂用于标准人群的危险性太高时，如标准人群表明抗原水平异常高，因而担心引起特异性毒性，或当标准人群如新生儿对毒性试验承受力极弱时。    b．当标准人群体质太差而不能获得明确的安全性资料时，如脓毒症患者。

    2．发起人及研究者应仔细考虑在单程或多程治疗中治疗策略是否是基于单次或多次使用药物。在可行的I期临床试验设计方案中，需要考虑在临床应用中最可能采用的单克隆抗体使用途径及时间。单克隆抗体的间发治疗或重复使用可改变其安全性及效力。例如，抗原量的改变（因抗原被单克隆抗体结合和清除或调理）及对单克隆抗体免疫应答的改变，例如不能从单剂量资料外推至多剂量方案。而且，在存在HAMA的情况下，重复使用单克隆抗体可产生毒性且丧失治疗效力。故需要研究能弥补高HAMA或循环抗原的改良剂量方案，包括药物动力学研究以决定HAMA效价或循环抗原水平及器官分布、清除以及毒性之间的关系。

    3．曾接触过异源蛋白或有异源蛋白变态反应史的病人，在进行同物种单克性机体的Ⅰ期临床试验时，应被排除在外。

    C．剂量设定

只要可能，I期临床起始剂量的选择应以相关动物模型的安全性及毒性资料为依据。从动物用剂量到人用剂量的探讨中，有关单克隆抗体对人抗原及其与动物类似物的相对亲和力资料有重要的参考价值。当不可能进行动物试验或动物分析结果无相关性，以及初始试验是在人体内进行时，临床试验初期应采用低剂量，此剂量是根据组织培养或类似单克隆抗体临床试验推定的。体内目的剂量或浓度范围的确定应以抗原一抗体亲和力及功能活性(免疫调理、细胞毒性）的细胞体外试验结果，结合相关抗原动物模型试验为依据。

    1．单剂量试验

    a．在Ⅰ期临床试验中，治疗用单克隆抗体的初始研究应为剂量逐步提高试验，其目的应是确定最大耐受剂量（MTD）和/或最佳生物学剂量（OBD），此剂量由替代实验室的测定结果确定（如：受体结合水平或目的物的血液水平）。毒性及有效性标准应具疾病和适应症特异性。应慎重地选择低于生物学活性剂量的剂量作起始剂量。在大部分试验中。应使用新的患者人群组试验每一种剂量。多种剂量递增方案得到广泛使用（13－15）。

    b．放射性免疫治疗用单克隆抗体的试验应采用传统的剂量递增方式，其最高及最低剂量是以动物剂量测定发为基础，根据正常器官的放射耐受性而定。

C．对于毒性反应，应明确规定停药及剂量改变的标准。对于生命未受威胁或慢性疾病，当遇到明显毒性药物时，在方案中应规定药物递减方案，相反，对于生命受到威胁疾病用的抗肿瘤制剂和其他药物试验有较高毒性耐受性常是适宜的。在任何疾病中出现非预期毒性，应重新考虑剂量递增方案、体内清除标准及受试人同意文件。安全性评估应包括有关实验的及临床的副作用。为了评价可能存在的反应，包括监测免疫功能恢复的彻底性，有必要进行长期的安全性跟踪，并在方案中注明此项内容。

    2．多剂量试验

    a．开发无免疫原性抗体可能便于应用重复剂量。

b．某一单克隆抗体若采用多剂量应用方案，则应在获得有关单剂量的最高水平。清除及毒性的基础资料后，在Ⅰ期临床中进行探讨。在采用多剂量应用方案以前，也应充分了解单剂量生物学作用后所需要的恢复时间（如放射免疫治疗后，CD4细胞缺陷或调理作用或骨髓功能好转后的免疫恢复）。无论采用何种多剂量方案，均应根据人和／或动物模型的剂量耐受及可获得的药物动力学和药效学资料提出方案的设计原理。

C．对于多次使用某一放射性免疫治疗剂或免疫毒素，研究人员应对所有器官毒性及其病理学进行精确地鉴定。应对从全部的毒性效应中恢复所需的时间段进行监测。通常不宜在病人体内做剂量递增试验，因为这种作法会产生毒性蓄积效应，特对骨髓，且难于确定这种效应是因长时间治疗还是因增加剂量而引起的。若初始剂量未出现毒性反应，或当耐受剂量的个体差异大，提示为初始安全“试验”剂量可在病人体内进行剂量增加试验。在不同病人中做剂量增强试验时，应考虑剂量值、存留效果以及临床和实验室不良反应恢复至基值的可能性。

3若与单克隆抗体结合的辅助治疗将作为常规使用方法，则应在I期临床中研究使用剂量及潜在的相互作用。

D．药物动力学

设计药物动力学试验方案应考虑产生免疫球蛋白的动物、免疫球蛋白种类和亚抗体（如：完整单克隆抗体，Fab片段等）或免疫结合物的结构。被试人群携带适当抗原及抗原量是至关重要的；这类试验可按抗原量分层次进行。药物动力学有助证明不同产品或剂型的相当性（见第Ⅷ章临床前试验）。药物动力学研究主要包括：

a．测定血浆浓度及清除；

b．根据与体外测定有效浓度的相关性确定最佳体内剂量；

C，确定峰值和基值及清除率系数，以利于多剂量方案的设计；

d．确定体内具清除作用的器官；

e．检测全分子及其成份，以监控免疫结合物；

f．研究体内清除与使用方法、抗原负荷及循环抗原和HAMA之间的关系。

  X．Ⅱ期临床试验

在Ⅱ期临床试验初期，应尽可能全面地鉴定抗体的特异性。

A目的

一系列设计完善的Ⅱ期临床试验方案对开展有决定性的成功的Ⅲ期临床试验具有重要意义。在中盘期临床试验期间应：

1．应探讨并建立临床使用的最可靠测量值或终末值。

2．应在Ⅱ期临床试验结束后，明确与制剂使用有关的剂量范围、途径、时间及其它技术因素。

  3．根据对治疗或诊断效果规模的估测，临时预测Ⅲ期临床应开展的适当规模。

  4．鉴别最可能对单克隆抗体显示良好效果或副反应的人群。

  5．应积累有关副反应的相关资料。

  6．通过测定实验室终点及其使用途径、剂量时间表、体内清除、抗原负荷和HAMA的相关性，研究单克隆抗体的作用机制（药效学）。

  B．被试人群

  1．Ⅱ期临床试验的对象，应不同于Ⅰ期临床的对象（如处于疾病的不同阶段、器官功能受损、具肿瘤实体、 performance statua、疾病持续时间、年龄、骨髓保留、先存免疫抑制、伴随非单抗治疗），特别应区别于那些可能将作为Ⅲ期临床或作标记指示的研究对象。若患者人群明显不同于Ⅰ期临床中所用的人群，则最好补充药物动力学资料。可能时应研究器官损伤（如肝，肾）条件下的体内清除状况。

2进一步的安全性调查应包括评估特定器官毒性和重复剂量的安全性（如：存在HAMA）。

    3．许多试剂产品的发展要求具有分别详述的患者治疗规则。应注意在病程中使用单克隆抗体或治疗有好转或有效的时间，与传统疗法的相互作用，以及预测每个病人对治疗反应的影响因素等。Ⅱ期临床为最终鉴定和验证将进入Ⅲ期临床及最后标定的治疗规则提供了的机会。

    C．剂量设定

Ⅱ期临床应对不同的和有代表性的患者人群应用的不同剂量和使用时间进行评估。应用生物学或生物化学方法测定制品的血浓度和/或其活性。疾病严重程度及患者人群统计的差异可能要求采取不同的治疗方案。在不同剂量的评估中，每个研究组中应拥有足够量的患者。效力替代指标对于选择单克隆抗体剂量或使用时间具有特别的指导作用。

    D．随机化

患者随机化对于比较剂量分析试验、评估使用冷抗体清除循环抗原或阻断非特异性单克隆抗体结合能力、确定合适的冷抗体剂量或确定药物使用时间或途径的重要性是很有价值的。在大多情况下，Ⅱ期临床最理想的作法是采用双盲法和随机化法，以免产生使人误解的结果，影响Ⅲ期临床的成功。

    E．Ⅲ期临床结束会议

在 Ⅱ期临床结束时，建议就效力试验的准备与 CBER协商，这种会议通常是建议性的，在会议前，发起人应向CBER提交下列资料：

    1．一份整理完善的临床资料总结，包括一份现有安全性资料和有关毒性的剂量反应效应的，总结，以及一份临床活性资料总结；

    2．包括效力试验在内的有关产品鉴定的完整资料；

    3．证明生产设施和生产方法能制备足够量产品，以满足Ⅲ期临床及初期商品市场的需要；

    4．有关生产合同、联合和分工生产安排的资料；

    5．分析性技术及生产的SOPs（标准操作规范），以证明在Ⅲ期临床期间产品批次间的持续稳定性。

6．与单克隆抗体联合使用产品的资料，如兔补体；此资料可以主档案形式提呈。

Ⅵ．Ⅲ期临床试验

   A目的

Ⅲ期临床试验的结果应为产品的审批提供决定性的效力及安全性资料。

    B．被试对象

一旦单克隆抗体进入市场，接受单克隆抗体治疗的任何组在Ⅲ期临床试验人群中都应有其代表。若有科学根据对单克隆抗体生物学分布、代谢或副作用因性别、年龄或种族差异而提出怀疑时，包容各类患者人群则尤为重要。

    C．剂量设定

在Ⅲ期临床试验前，应通过替代或临床终点尽可能确定一个有可以接受毒性的曲线的有效剂量范围。在皿期临床中，最好设计2种或2种以上的剂量或使用时间。

    D．制品问题

1．Ⅲ期临床试验所用的产品应以预定进行商品化生产的工艺、生产规模及设施进行制备。

  2在Ⅲ期临床试验前，应注意扩大生产规模计划及预定的产品生产的改变。若在Ⅲ期临床结束后生产发生重要改变（如：细胞库改变，含血清培养基改为无血清培养基，或生产场地或部分场地的改变），则可能有必要进行临床试验，这取决于临床前的生物化学、药物动力学及功能性资料比较（见第V章）。

    3．在Ⅲ期临床中；发起人应试验若干不同的产品批，以证明能生产确实实全有效的产品。

    Ⅻ．免疫原性：临床考虑

监测抗球蛋白效价和免疫活性，对于评估单克隆抗体的安全性和效力，制定有关再治疗方案是非常重要的。对单克隆抗体免疫应答的后果包括对单克隆抗体效力的干扰及各种各样潜在的危险的免疫学反应。

    A．产生抗单克隆抗体抗体的监测

现已对HAMA的检测方法进行了充分研究。根据单克隆抗体的来源，需研究其他检测抗免疫球蛋白的方法，以检测人抗大鼠抗体（HARA）和人抗嵌合性的、人源化的及灵长目的抗体，及人抗免疫核素、免疫毒素、其每种组分（如蓖麻蛋白）和由抗体／毒素／核素偶联的新抗原。

    1．安排HAMA检测样品的收集时间时应该考虑预定使用单克隆抗体的目的是单次还是多次。通常应根据基值及以前存在抗体（包括抗球蛋白抗体或抗结合物抗体）再次应用单克隆抗体之前确定HAMA滴度，用后的样本可以早取（如使用后 2周），但是还应在晚期的某个时间（如：6～8周）取样。

    2．任何选定的HAMA检测方法应达到可能程度的标准化。应选择人源或灵长类源的有确定特异性的抗小鼠抗体制品作标准并分装冻存，这将有利于后期进行种内或种间研究的比较。这套标准也能用于建立常规检测的线性标准曲线。应采用抑制或竞争方法及适当的阴、阳性对照确定单克隆抗体的特异性。也应研究正常反应性的范围，评估因血清成份如胆红素和脂类的可能干扰。应证明试验方法灵敏、特异、精确、准确。

    3．应鉴定并分析患者对单克隆抗体免疫应答特异性的特征，如：所产生的免疫应答抗重链同种型还是抗轻链，抗恒定（C）区、可变（V）区、独特型表位，还是抗免疫结合物或抗新抗原。这些资料将表明是否可使用具广泛特异性的HAMA检测方法（检测人抗体与所有的小鼠免疫球蛋白类别的重链和轻链恒定区抗原的反应），或表明是否有必要使用限制性更强的独特型抗体特异性的HAMA检测方法。在某些情况中，HAMA检测方法有必要使用单克隆抗体制品作为检测抗原。

4．选择适当的HAMA检测方法取决于单克隆抗体使用目的及制品的标记方法。在一种新单克隆抗体的临床开发调查阶段，应同时建立一种HAMA检测方法，并对其进行验证。如HAMA反应对单克隆抗体的安全性、效力或最佳剂量有影响时，则HAMA检测结果应与制品的效力及副作用具有相关性。

5．一种可准确测定对单克隆抗体的HAMA反应性的经过验证的检测试剂盒应与带有重复使用指征的单克隆抗体PLA试剂盒协同使用。如果HAMA检测试剂盒能够有效地检测到改变新单克隆抗体制品的药物动力学，安全性和/或效力的HAMA；市场销售的HAMA试剂盒则是有效的。若不能获得适当的HAMA检测试剂盒，发起人则应建立一种适当的经过验证的检测系统。

    B．免疫原性的临床后果

    1．通常不提倡使用皮肤试验，因皮肤试验对小鼠蛋白的灵敏性差，且能引起致敏。

    2当存在HAMA时，则应预先防止出现副作用并采取适当的措施。因有发生潜在的威及生命反应的可能性，通常应在能当即获得急救的设施中给病人用单抗。应根据临床安全性资料判断在非医院设施的条件下使用单克隆抗体（如：在临床或家中）的可行性。在输注单克隆抗体后至少密切观察1小时。试验设计应考虑并反映出对单克隆抗体免疫应答的迟发副作用的可能性，包括进行适当的临床及实验室检测。

    3．过敏、过敏样及其他免疫反应

    a．真正IgE介导的抗全小鼠免疫球蛋白的过敏反应是很少见的。理论上讲，可能出现抗人同种异型的变态反应，但至今尚未报导其临床重要性。若单克隆抗体与螫合剂或毒素偶联，变态反应发生的可能性会较大。综合来看，单克隆抗体的重复使用增加了发生过敏反应的可能性。同样，接触过小鼠蛋白的个体会被致敏。急性过敏反应的范围可从温和型（如皮疹、荨麻疹、血管性水肿、哮喘）至重症型（晕厥、呼吸衰竭）。

    b．输液性反应如发热、后背疼痛及恶心已通常在单克隆抗体使用期间或使用后立即出现（发生率约5%）。这些反应的机理尚不清楚，但它可能与蛋白聚合体有关。通  常可通过降低输液速度或调整治疗方案控制反应的频率及强度。

  C. 单克隆抗体治疗后很少发生血清病。不同于在抗体治疗期间或治疗后随即发生的过敏反应及输液反应，血清病延迟出现。应测定循环中存在的高滴度可溶性抗原．该抗原与单克隆抗体的副作用相关。

  4．HAMA通过与鼠源检测抗体结合，可以直接干扰以鼠源抗体为基础的抗原临床检测如 CA-125和CEA。若单克隆抗体的使用诱导出模拟抗原的抗-独特型反应，则理论上可以出现与诊断试验的间接干扰。若可能，应利用设计完好的体外分析系统地找出每种干扰类型的证据。理想的情况是，努力避免出现这种干扰作用，并验证其它的临床方法。

  5．当某一人群被选出进行单克隆抗体试验时，由于可能诱发HAMA或其他抗球蛋白，应考虑到给将来用单克隆抗体进行治疗带来的风险。

  ⅩⅢ．剂量测定

  应提供充分的动物或人体试验的资料，以便合理计算用于人体全身的及重要器官的放射性吸收剂量（2 CFR 312 23（a）（10）（ⅱ））。

  A．靶器官辐射剂量的计算

  研究人员应根据患者平均值确定：

  1．放射性在靶组织/器官的累积量；

  2．放射性在靶组织／器官临近组织的累积量；

  3．放射治性单克隆抗体在靶组织/器官及其临近区域存留时间；

  4．放射性同位素的放射剂量，包括游离同位素及任何由放射性同位素裂变而产生的子系产物；及放射性剂量，包括与制备后立即使用的及推迟至半衰期终点使用的放射性免疫结合物结合的、游离的及子系放射性同位素。

  B．最大辐射吸收员

  用于人体的放射性物质的量应为最小的放射性剂量，该剂量是在流程操作中有实效的，但并不影响研究的结果。

  1．应采用体内放射剂量测定法计算在体内使用放射性标记抗体所产生的放射量。在两个组织中分别阐述了放射性剂量的吸收比值的测定方法，其一为核医学学会的医用体内放射剂量委员会（MIRD），另一为：放射性保护国际委员会（ICRP）[21 CFR61 1 Cb（iv）］。由这两个组织之一所测定较高的吸收剂量估测值应用于放射性剂量测定法安全性评估中。

  2、测定法评价应包括下列方面：所有的靶器官／组织、骨髓、肝脏、脾、肾、肺、心脏、尿道、膀胱、胆囊、胸腺、大脑、生殖腺、胃肠道及与已知或预期接触具相关毒性放射性的临近组织。

    3．提供计算结果应体现与放射性免疫结合物代谢或排泄的重要器官发生病变（如肾功能障碍增加的肝胆功能或肝功能障碍导致的肾清除功能增加）时可能出现的剂量测量法的改变。

4．应提供计算放射性剂量和吸收剂量比值的数学公式，应列出样品计算过程及所有相关的假设。

5．剂量估测的计算结果应在放射性标记抗体的最高半衰期进行以提供放射活性衰变的污染物的上限，并应：

    a．包括将被使用的最高放射性量；

    b包括作为研究的一部分的其他诊断程序，如X线照片或核医学扫描而引起的放射性暴露；

    c．放射剂量应表示为：每毫居里放射核素Gray（Gy）数；及

d．以表格形式表示并包括靶组织／器官及第V章C．2中所列器官各自的吸收放射剂量。

    XIV．癌造影制品

    A．早期临床试验

在从若干种候选抗体中挑选将用于试验的抗体时，了解该抗体与靶细胞结合及与背景结合的相对比例是很有价值的。造影制品的Ⅰ期临床应在表达这种抗原的患者人群中进行。

    1．早期临床试验应收集有关资料：剂量效果、使用途径及程序；同位素、结合物及游离抗体的排泄途径；结合物或螫合物体内稳定性；及器官损伤、循环抗原量及肿瘤负荷的影响（有关药物动力学的）。应在早期临床研究期间考核冷抗体的使用效果。

    2．测定放射剂量时，应同时注意因抗体剂量引起的变异。剂量测定法包括对内部及排泄的剂量测定，并计算肿瘤和不同器官（见第 V章）的最大放射剂量。

    3．应进行最适造影次数和技术及所需造影设备的初步估测。

4．应估测制品对可测的或隐蔽的疾病及最小可检测的疾患的造影能力，并估测不同器官的造影质量。

5．若可能，资料应与标准的诊断技术相比较，但不能用于患者的管理。

6．通常应寻求造影质量的初步证据，并作为后期临床研究设计的基础。

    B．扩大临床试验

Ⅱ期临床为Ⅲ期临床选择适当的患者人群提供了机会，并改进了扫描的技术问题。在此阶段应进行抗体剂量的比较，随机化也会有很大帮助。

    1．造影制品的Ⅱ期临床应尽可能限定获得许可证的制品的临床使用背景。例如：一种癌症造影制品可用于病人筛选、初期检查、检测隐藏疾病或复发分期。它仅对排除或限定癌症时有价值，或对两者均有意义。研究人员应注意造影效果可受疾病特异性因素（如疾病阶段、肿瘤、负荷、循环抗原水平、？病理性疾病）和技术因素（如造影时间、最佳造影所需视图、设备、冷抗体的使用）的影响。

2在Ⅱ期临床中应取得在各种环境下诊断有效性的初始证据（如灵敏度、特异性、预期值）。造影制品诊断有效性应与“金标准”试验一致，例如组织病理学或在某些情况下，用传统的诊断模式。若无这种标准，则结果应与临床结论有相关性。

    3．在 Ⅱ期临床中，应收集足够的资料以制定在特定的仔细鉴定过的临床环境的临床应用假说，其临床环境将会在以后的正式的效力试验中进行评估。应鉴定最适宜的效力试验的测量方法或终点。在Ⅱ期临床中应建立可说明造影制品如何配合病人检查的计算概要。

4．在 Ⅱ期临床中应通过获得有关循环肿瘤相关或肿瘤特异性抗原、肿瘤负荷、造影次数及热／冷抗体比率的选择的影响的进一步资料更精确地确定剂量。

5应获得有关器官剂量测定和副反应的补充资料，以便为进一步临床试验选择使用剂量和方案。

6．在Ⅱ期临床期间，应收集多个临床研究现场的资料，以证明在各种环境中可进行可靠的现场同位素标记，其无菌性、纯度、免疫反应性的保留及高特异性活性均符合要求。

7、只有在对一种制品的单次使用情况作了正确评估，并收集到足够的有关HAMA的研究和副作用的资料后，才应该为重复造影分析而再次给病人使用单克隆抗体。

    C．效果试验

    1．临床方案中应包括下列内容：

    a．预先确定的详细的临床效力终点和分析计划；

b．当制品被批准后，则由预定接受造影的患者组成被试人群；

C．应有获得和保存试验用胶片和/或试验试剂及比较试剂的数字化资料的计划；在研究开始以前，应向CBER人员咨询有关资料的结构、改变、表现形式及保存等技术细节。

d．提供与事先指定的标准造影技术（若有）比较的资料。应具有书面的阅读所有扫描结果的标准操作程序。除试验性和常规的扫描现场读数外，建议由未接触过比较试验及详细临床资料的独立人员或委员会成员随机抽样分析。当实验性的常规的对照扫描设计用于阅读其他临床资料的内容时，则应指明那些资料的确切性质。

2．Ⅲ期临床试验的初级效力终值中应包括对临床收益的论证。灵敏度、特异性和预期值通常不适合于初级终值，也不能满足造影制品在Ⅲ期临床中的替代品效力。应提前指明并根据临床效力估测的性质判断灵敏度或特异性是否以每个患者或每一损伤为基础进行计算。一般说来，临床效力最好以每个患者为基础进行评估。造影制品的潜在的临床效益的定义可包括：

    a. 初级终值证明了治疗效果有所提高：新的试验提供了一种更为精确而快速的诊断技术，此技术对存活时间、无疾病时间、无症状生存或死亡率下降作出诊断和预测。

b．初级终值表明了对患者管理有所改进：1）由于试验提供了有关疾病程度（即阶段）的更精确的资料，外科医生可摘除更多的肿瘤组织或缩短手术时间，因此避免了潜在的致病的手术程序；2）若检测到不可治愈的转移性疾病，更精确地确定病程有助于选择适当的辅助治疗方法。或避免潜在的毒性药物疗法；3）疾病程度测定方法的改进有助于可预测（及可能防止）重要的并发症（如：脊髓压迫、上腔静脉结合症等）；4）新的检测手段发现了传统诊断方法漏检的同期初发肿瘤（如多克隆性原发肿瘤、对测乳腺肿瘤等）。建立以改进患者管理为目的试验要求有新的方案：设计方案可包括下列方面：

    （1）只要可能，初级终值表示为带有一置信区间的数学量值（如：新的方法在传统诊断技术检测为阴性的患者中检测出10％的人具有隐性疾病；新的检测方法可使得10％先前以传统方法分病程的病人的病程分析更精确化）。

（2）应认真控制在病人检查和治疗疾病的不同阶段对病人的管理策略，因此策略可能会受到调查时的诊断扫描结果的影响。在进行调查试验前，应制定有关诊断可能性的提问的数据表格，此数据表格为特异性的、公正的，包括有关何人填写表格，检查过程何时完成等要求。表格应同时完成。另外，在无实验性检验标准的情况下，应在开始试验前确定随后应开始实施的管理计划，以利于与新的试验中所产生的修改的管理计划作比较。

（3）应确定可用于改变诊断和管理的新试验的推荐方式，方案中应注明设想的效用是否包括采用取代或补充其他试验（及其他试验的内容），是否新试验将用于决定其他试验是否进行。

（4）在副作用极小的情况下，可以论证有效诊断信息的终值代替经论证的对病人管理的改进。在估测危险性与效益时，应考虑的新试验的副作用可包括：患者的不适、有关将来诊断治疗干扰的不良影响（如HAMA或延迟手术施行或延长手术的时间。

    C．初级终值表明了患者改进的舒适或舒适程度：

l）新试验代替了一种或一组当前进行的试验，而提高了耐受及舒适程度；

    对新试验提供了更为精确的可缩短术后期限的诊断信息。应就在临床试验中使用这些终值与CBER进行讨论。

d．检测提供了通过其他方式不能取得的独特信息，若信息可靠且对病人有固有的价值（如确定预后或预测以后的治疗），其价值超过了试验的危险性，则无直接临床效益的此类信息可考虑作为效力依据。

e．初级终值与现存检测方法相比具有诊断等效性，特别具有安全、便利及／或定时的优越性。等效临床试验应具有检测新造影制品中低劣的诊断操作的预定效能。在方案中应详细描述确定等效操作的统计学方法。

          附录1  交叉反应性试验用的正常人组织

  肾上腺           胃肠道         前列腺

  膀胱               心            皮肤

  血细胞        肾（小球，小管）   脊髓

  骨髓               肝             脾

  乳房               肺           横纹肌

  小脑             淋巴结          睾丸

  大脑皮质          卵巢           胸腺

  结肠              胰腺          甲状腺

    内皮         甲状旁腺         输尿管

    眼              胎盘     子宫（子宫颈，子宫内膜）

    输卵管          垂体

                附录2   小鼠抗体产生试验

来源于小属细胞系的任何主细胞库（MCB）和生产终末细胞（EPC），以及来源于小鼠腹水的所有批号单抗应进行下列小鼠病毒试验【小鼠抗体产生试验（16）］：

    小鼠脱脚病毒                 小鼠脑脊髓炎病毒

    兽疫幼鼠腹泻（EMID）病毒       小鼠肝炎病毒

    GD7病毒                  小鼠垂液腺病毒（小鼠CMV）

    Hantaan病毒                    小鼠肺炎病毒

    淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒        多瘤病毒

        （LCMV），用非致死株攻击   呼肠孤病毒3型

    乳酸脱氧酶升高病毒(IDH）        仙台病毒

    小鼠细小病毒（MVM）             胸腺病毒

    小鼠腺病毒（MAV）

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

核酸特性鉴定和遗传稳定性

（ FDA，   1992年 4月 6日）

《用rDNA技术生产新药与生物制品的考虑要点》的补充

    1．前言

本文是关于用真核及原核细胞生产rDNA蛋白产品所用表达载体的鉴定指南。表达载体是指含有编码重组蛋白序列的表达载体。表达载体的特性鉴定是《用rDNA技术生产新药与生物制品考虑要点，1985》所注意的问题之一。自那以后，蛋白分析技术和核酸特性鉴定与发酵和细胞培养工艺平行地取得了进展。本文的意图是推广和阐明那些对确定生产rDNA蛋白用表达载体结构有价值的信息。在制定该文中，我们考虑了生物化学技术的新进展、不同生产系统的既往历史、来自国际会议的信息、以及提交给FDA的意见。特别是1991年召开的国际传代细胞一当前问题讨论会对这些问题进行的详细讨论。CBER科学专家们确信，本文提出的补充指南反映了科学界的一般见解，并阐明了鉴定核酸的特性和确定遗传稳定性需要进行的试验。CBER认识到，这是工业界特别关注的领域之一，对本文提出的意见在以后修订《用rDNA技术生产新药与生物制品的考虑要点》中将予以考虑。

    Ⅱ．表达载体核酸特性鉴定的理论基础

重组蛋白是在活细胞中产生的，活细胞会突变，从而会改变某一蛋白的性质，使其对人具有潜在不良影响。没有任何简单的实验方法可以检出某一蛋白所有可能变易。蛋白分析技术可用于确定表达蛋白的许多结构特征，以及由于转译后修饰系统，诸如影响蛋白水解加工、糖基化、磷酸化、乙酰化及蛋白其他变易（如脱酰胺基，氧化）造成的一些改变。但是，分析最终的纯化蛋白可能检查不出来由于编码蛋白序列突变导致某一蛋白结构的所有变易。例如保守氨基酸的置换可能被肽图技术漏检，并仍可引起蛋白结构的改变。某些改变可能不影响体外活性，但是，可引起明显的体内的效应，如导致药效学、药物动力或诱生抗体应答方面的改变。在大量产生外源蛋白的某一细胞群体中，产生某一变易蛋白或产生蛋白量减少的突变细胞可能具有生长优势，于是，经许多代后，细胞群体中的这类细胞增多。在鉴定最终纯化蛋白时，可能漏掉已合成但又被下游工艺去除的变易蛋白。在纯化步骤的效能发生故障时，这些变易蛋白可能污染最终的纯化蛋白，尽管在理论上可在DNA或RNA水平上检出编码蛋白基因的突变。因此，应仔细选用包括纯化蛋白及核酸二者都能分析的综合方法，以确保产品的连续一致性。

用分析生物化学技术分析纯化蛋白的数据比较容易解释，并在《用rDNA技术生产新药与生物制品的考虑要点，1985》中讨论过。在某些情况下，从最终产品的角度很难解释核酸试验结果。但是，将此类数据作为纯化蛋白分析数据的补充。可提供有价值的信息。可用核酸分析验证编码蛋白的序列及表达载体的物理状态。验证编码序列不是为了检测低水平的变易序列，而是验证细胞经全规模生产过程操作后，纯化之前，占优势的蛋白种类具有正确的氨基酸序列。当生产细胞的表达载体有多个整合考贝时，可能不是所有考贝都有转录活性，用mRNA或cDNA分析检查转录产物本身，可能比分析DNA基因组更为适宜。如用聚合酶链反应扩增的材料检查大量群体的核酸，可能比用取决于个别DNA克隆选择的方法更为可取。

应提供下述各节叙述的，在开发和验证生产用细胞克隆过程中鉴定表达载体的资料。这些建议是基于目前的技术提出的，可以预见，随着该领域新技术的发展和我们认识的提高，将会对其进行修订。

Ⅲ．表达载体的特性鉴定

    A．初始细胞克隆

    DNA克隆

生产者应说明编码蛋白DNA的制备方法，包括细胞及原料核酸的来源。

应详细说明表达载体的组建步骤，应包括表达载体组件的来源和功能，例如，复制的由来，抗生素抗性基因，启动子，增强子，合成的蛋白是否是融合蛋白。应提供限制性核酸内切酶消化图谱，说明构建表达载体所用的位点，以及鉴别DNA片段所用的位点。

应进行表达载体编码蛋白区的全氨基酸序列分析，应提供序列分析结果，包括所有标明的重要序列特征的完整评注。例如，与构建有关的位点，不同于原序列的改变。若编码蛋白区含有编码序列以外的信息，如内含子或侧翼序列，则应对这些附加序列进行特性鉴定。

    细胞表达克隆

预定产生蛋白的宿主细胞系统应与表达载体相容。为此，提供有关细胞来源、表型及基因型的说明很重要。宿主细胞应按《生物制品生产用传代细胞鉴定的考虑要点，1987》充分进行鉴定，应提供有关表达载体导入宿生细胞方法的说明。另外，应全面说明扩增表达载体及选择生产用细胞克隆所用的方法和标准。表达载体的考贝数及物理状态亦应确定。

    B．基础细胞库

基础细胞库（MCB），是等量分装后在规定条件下保存的一批组成均一的细胞，用其制备所有的次级细胞库（按《生物制品生产用传代细胞鉴定的考虑要点，1987》所述）。MCB一般是由含有表达载体的单个宿主细胞克隆建立的。应说明克隆经过，包括有关建立MCB及方法学资料。若采用将表达载体导人宿主细胞，随后进行克隆筛选的方法建立新的细胞库，应说明新克隆及所产生蛋白的合格标准。每一MCB细胞应进行适当表型标记检查，例如，营养缺陷及抗生素抗性，以确保其同一性和纯度。每一MCB应进行外源因子检查，基适宜，按《生物制品生产用传代细胞鉴定的考虑要点，1987》进行。MCB应定期进行特性鉴定，以确保其活力。

    每一MCB最少要测定一次表达载体的完整性。应验证编码蛋白的核苷酸序列。带有编码蛋白基因单基因组考贝的细胞，测定总基因组DNA序列可能比测定单基因组序列更为可取。带有多染色体插入表达载体的细胞应用mRNA或cDNA直接序列测定法测定编码产物校酸序列。对于染色体外表达系统应分离表达载体，在不进一步克隆的情况下验证编码产物核苷酸序列。MCB细胞的表达载体应用限制性核酸内切酶图谱法分析考贝数，大的插入段及缺失段，以及整合位点数目（带有多染色体整合的细胞）。对于染色体外表达系统，应在有选择及无选择的培育条件下测定宿主保留表达载体的百分比。上述检定亦适用于新建的MCB。

    C．生产用细胞库（ MWCB）

MWCB是按《生物制品生产用传代细胞鉴定的考虑要点，1987）由1安瓶或以上MCB细胞扩增建立的。每一MWCB是等量分装后在规定条件下保存的一批组成均一的细胞。应详细叙述MWCB的制备，包括培育过程中所用的方法和试剂，由MWCB算起的群体倍增数，以及保存条件。在保存期间，应用限制性核酸内切酶图谱确定表达载体考贝数及插入段或缺失段的方法鉴定MWCB的同一性。另外，必要时，应用表型鉴定法，例如，营养缺陷，抗生素抗性鉴别MWCB。

    D．生产终末的细胞

生产终未的细胞是由MWCB扩增的按全规模生产条件在一次实际生产过程中结束时取得的细胞。每一MWCB应按本文 Ⅱ项规定鉴定一次生产终未细胞表达载体的完整性。全规模生产设施的生产终末细胞应重复进行实验规模设施的生产终末细胞所进行的鉴定。

重要的是应说明，上述对生产终末细胞进行的鉴定，不是指每一次生产过程结束时都要进行。在每一生产周期结束时，应进行有关细胞表型或基因型标记分析，并按《生物制品生产用传代细胞鉴定的考虑要点，1987》进行外源因子污染检查。全规模培养收率稳定性资料应予保存，并应建立废弃培养批的标准。

Ⅳ．结语

    表达载体和纯化蛋白的鉴定是rDNA产品生产稳定一致性的重要保证。目前，确信单靠核酸鉴定或蛋白结构分析资料，不能全面确定rDNA蛋白产品的同一性和纯度。随着技术的进展，将再次评述这一见解，并修订本文。

关于生产r-DNA源性蛋白产品用细胞表达结构分析的指南

草案

（FDA，1995年8月）

    Ⅰ、前言

本文叙述的是用真核细胞和原核细胞生产r-DNA蛋白产品的表达结构鉴定指南，本文阐述评估生产重组r-DNA源性蛋白所用表达结构的各种有价值资料，但并不涵盖r-DNA源性医疗制品的所有质量问题。

表达结构的定义为：重组蛋白序列的表达载体，应用核酸技术与纯化重组蛋白试验相结合分析表达结构的各部分，以保证产品的质量和连续稳定性。考虑到这种试验仅仅是对编码重组基因的序列而不是转录的真实性或者重组蛋白其他特性的评价，如二、三级蛋白结构和转录后修饰，所以从核酸水平上分析表达结构只能作为全面质量评价的一部分。

    Ⅱ：表达结构的常现分析的理论说明

表达结构分析的目的是为了证明正确的产品编码序列已掺入宿主细胞，在培养过程中保持至生产结束，用活细胞生产的重组蛋白基因序列可能发生突变，此突变可能会改变蛋白质的特性对患者有不良的影响，没有能检测出蛋白所有可能修饰的单一的实验方法，可用蛋白质分析技术确定蛋白质的序列或者经过对蛋白水解加工、糖化、酸化、乙酰化等过程的分析和转录后修饰的表达蛋白的结构特点进行评价。核酸分析资料可能更有用，因为蛋白质分析方法不可能检测出由于重组蛋白质编码序列突变引起蛋白质结构的所有改变。核酸分析和蛋白质分析的相对重要性因产品不同而异。

核酸分析可用于确认表达结构的编码序列和物理位点，进行核酸分析是为了保证表达的蛋白有一个正确的序列，而不是检测低水平的变异序列。在生产细胞内有多个表达结构的整合拷贝，当然不是所有的表达结构都有复制活性，用mRNA或者cDNA分析来鉴定复制产品本身可能比分析引基因组DNA更为合适。如同检测混合克隆或者PCR扩增的材料一样，认为检测大量核酸所用的分析方法是进行单个DNA克隆时应采用的方法，其他能快速而灵敏的确定表达结构中编码重组蛋白序列技术也可考虑。

下列章节叙述了在开发和验证生产系统过程中应提供表达结构鉴定资料，证实序列所用的分析方法学应经过验证，验证文件至少应包括检测变异序列限度的估计，无论是对核酸还是对蛋白测序方法都应这样作。本文所述分析方法的原理和建议应利用高新技术和科学信息定期加以修定。

    Ⅲ：表达系统的鉴定

    A．建立主细胞库所用的表达结构和细胞克隆

生产者应说明编码蛋白的核苷酸序列来源，这包括原初供给核苷酸序列细胞的确认和来源。应说明制备编码蛋白的DNA所用的方法。

应详细叙述装配表达结构的步骤，应包括表达结构各组成成分的来源和功能，例如，复制起点、抗生素抗性基因，启动子，增强子和所合成的蛋白是否为融合蛋白等。应提交一个详尽的组份图和质粒完整的可阅读序列，其中包括在构建过程中已测序的区域和来自基因文库的区域，应对由质粒表达的其他蛋白加以说明，有意义基因编码区的核苷酸序列和插入到载体上的相关非结构区，还有插入的连接物都应通过DNA序列分析加之鉴定。

应说明表达结构转化宿主细胞的方法，另外、应详尽阐述表达结构扩增的方法和用于生产细胞克隆的选择标准。

    B：细胞库系统

重组蛋白的生产应以定义明确的主细胞库和生产用细胞库为基础。一个细胞库是一个在同一界定条件下存贮的由组成均一的一批细胞，每一安瓶装有等量单一的混合细胞。主细胞库（MCB）一般来源于含有表达结构的被选细胞克隆，生产用细胞库（WCB）是通过扩增来源于一个或者多个MCB安瓶。应详述细胞系的历史和细胞库的制备，包括细胞培养所用方法和试剂、体外培养龄、储存条件等都要详细说明。所有细胞库都应进行表型和基因型标记鉴定，包括重组蛋白的表达或者表达结构的复制。

MCB中的表达结构应按如下方法进行分析，如果不能用MCB试验，则用每一个WCB进行试验。

应用限制性内切酶图谱和其他适宜技术分析表达结构的拷贝数，插入和缺失位点以及整合位点的数目，对于染色体外表达系统，应对含有表达结构的宿主细胞的百分比进行检测。

要验证表达重组蛋白产品表达结构的蛋白编码序列，对于染色体外表达系统，要分离其表达结构并验证编码产品的核酸序列，不要进一步克隆对有表达结构的染色体拷贝的细胞，要通过再克隆和染色体拷贝序列分析来鉴定编码产品的核酸序列，当然，也可通过混合cDNA克隆或者PCR扩增物的序列分析技术来测定编码产品的核酸序列。在方法学的检测限度内，核酸序列应与本文Ⅲ．A所述的为表达结构所能确认的序列一致，也应与预期的蛋白序列相符。

    c：生产用细胞的体外培养龄范围

生产用细胞体外培养龄范围应以在中试或全规模生产条件下扩增的生产细胞和推荐的细胞体外培养龄或超过此龄的资料为依据，一般而言，生产细胞是由WCB扩增而来，有正当理由时可用WCB制备生产细胞。

除非生产细胞中表达结构的蛋白质编码序列经过核酸试验或者终产品分析验证，否则应象Ⅲ．B．所述那样再次对MCB生产细胞的表达结构进行分析。为了生产而扩大规定的细胞体外培养龄范围，应以已扩增至等于或大于新的细胞体外培养龄限度的某一细胞资料为依据。

    Ⅳ：结论

    鉴定表达结构和最终纯化产品对于保证重组DNA产品的连续生产稳定性都很重要。如上所述，核酸分析和最终纯化产品评价的分析资料对于保证重组蛋白产品的质量是必不可少的。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

生物制品无菌试验规程

（WHO 1995修订讨论稿）

      前言

《生物制品无菌试验规程》自1973年发表后又有了一些新进展，因此，将检查支原体的无菌试验要求修订如下：

    5.3检查支原体的无菌试验（ WHO TRS和 No．530，1973，Annex 4）

该节以下文取代：

    检查支原体采用琼脂和肉汤培养基培养法或指示细胞培养DNA染色法。

在要求基础细胞库、生产用细胞库、病毒种子批（或库）、或对照细胞进行支原体检查时，采用培养法和指示细胞培养法。在要求病毒收获液、疫苗原液或成品批进行支原体检查时，采用培养法。必要时，亦可用指示细胞培养法筛选培养基。

    培养法和指示细胞培养法见附录。

其他方法，只要列出详细步骤，井用本法验证过，亦可采用。

          附录 检查支原体培养法和指示细胞培养法

    1．培养法

    1．1培养基的选择

试验采用足量固体和液体培养基，以确保在选定的培养条件下检出产品中可能存在的少量支原体。液体培养基应含酚红。培养基的营养性能最少应用下列支原体验证：

    口腔支原体（M．orale）（人用疫苗）；

    肺炎支原体（M．pneumoniae）（人用疫苗）；

    猪鼻支原体（M．hyorhinis）（非禽类兽用疫苗，例如 DBS 1050）  ；

鸡败血支原体（M．gallisepticum）和滑液支原体（M. Synoviae）（在生产过程中采用禽类材料或疫苗拟供家禽使用）。

采用低代试验菌株，冻存或冻干保存。菌种经克隆后，应以适当方法确认是规定的菌种。

                      有些国家进行嵌入支原体检查。

  1·2培养条件

    将已接种的培养基分成两份，一份置需氧条件下培养，另一份置厌氧条件下培养。需氧条件是在含5—10％CO2和适当湿度的空气环境中培养。厌氧条件是在含5－10%CO2和适当湿度的氮气环境中培养。

  1．3营养性能

    用适宜的试验菌接种选定的培养基，每支固体培养基干皿不少于200CFU，不超过400CFU，每支液体培养基容器不少于20CFU，不超过40CFU。每种菌株单独接种一支平皿和液体培养基。接种的培养基置检定检品的条件下（需氧、厌氧或需厌氧，依试验菌的需要确定）培养。若试验菌生长充分，并液体培养基颜色有适当变化。则培养基营养性能试验符合要求。

  l·4抑制物质

  在检品存在下进行的营养性能试验与无检品存在的试验比较，若试验菌生长明显减少，则检品中含有抑制物质，在检查支原体之前必须将其中和（或用其他方法抵消，如稀释）。中和后再次进行抑制物试验，以检查中和法或其他方法的效果。

    1．5检品的克原体检查

固体培养基用直径60mm的平皿，每支含9ml培养基。最少用2支平皿，每支接种0.2ml检品，并接种100ml液体培养基，每瓶接种检品 10ml，置35一38℃需氧及厌氧条件下培养21天，同时培养100ml未接种的液体培养基作为对照。若液体培养基的pH加检品后显著改变，则加Na0H或HCI溶液调回至原pH值。接种后第1、2或3天进行次代试验，每一液体培养基接种 2支固体培养基平皿，每支 0．2ml，置35一38℃需氧和厌氧培养至少21天。于试验的第6、7或8天重复一次，第13或14天再进行一次。液体培养基每2或3天观察一次。固体培养基每周观察一次。

若液体培养基显示有细胞或真菌污染，应重试。若接种后不早于7天。每个试验阶段偶然污染细菌或真菌，或破碎不超过一支平皿，只要直接检查未证明有支原体生长，可以忽略不计。若在试验的任一阶段，有一支以上平皿偶然污染细菌或真菌，或破碎，试验不成立，必须重试。

在培养期结束时，镜检所有已接种的固体培养基是否有支原体，若任何已接种的培养基都无支原体生长，产品为通过。若有支原体生长，可用2倍接种量和培养基量进行重试，若无支原体生长，产品为合格。

    2．指示细胞培养法

细胞培养用与DNA特异结合的荧光染料进行染色，根据细胞表面，若污染严重，根据周围区域或特有的荧光颗粒或细胞丝模式检查立原体。

    2．1细胞基质的验证

用Vero细胞培养，试验前，用在液体或固体培养基上容易生长的，并证明能检出潜在支原体污染的菌株，如猪鼻支原体DBS1050和口腔支原体1596，或其他适宜菌株，接种量不超过100CFU。

亦可用其他细胞基质，如生产用细胞系，只要证明用其检查潜在支原体污染的敏感性至少相同。

2.2试验方法

最少取1ml被检材料，接种2个或2个以上50%长成片的指示细胞培养物，并不少于 25cm2细胞面积，至少传一代。最后一代于适当容器中的盖玻片或其他适合试验要求的表面上培养。

试验包括1个阴性（未感染）对照和2个支原体阳性对照，如猪鼻支原体和口腔支原体。阴性对照接种量不超过100CFU。

若检查病毒悬液，试验结果和判定受细胞病变影响，可用对支原体无抑制用用的特异抗血清中和病毒，或用不能使病毒生长的细胞基质进行。

    2．3步骤

    （1）将常规浓度的种子培养物｛2*104－2*105细胞／ml，4*103－2．5*104细胞／cm2)于36±1℃培养至50％生长成片。接种检品，培养至生长成片。

（2）吸出并弃去培养液。

(3）用pH7．4磷酸盐缓冲生理盐水淋洗单层细胞，然后用pH7．4磷酸盐缓冲生理盐水与甲醇等量混合液淋洗，最后用甲醇淋洗。

（4）加甲醇，静置10分钟。

（5）吸出并弃去甲醇。

（6）若以后要进行单层细胞染色，则使其完全干燥。

（7）若直接进行单层细胞染色，用无菌水洗去酸性甲醇，并弃去洗液。

（ 8）加 bisbenzimid工作溶液或其他适宜 DNA染料，静置 10分钟。

（9）去除染料，用水淋洗单层细胞。

（10）用一滴甘油与pH5．5磷酸盐枸橼酸盐缓冲液等量混合液封固每一盖玻片（如应用）。从盖玻片的边缘吸去多余的封固液。

（11）放大100－400倍或以上检查表面荧光（用330nm／380nm激发光滤片，LP440nm抑制滤片）。

（12）对比镜检被试培养物、阴性对照和阳性对照。

如未证明被检培养物中有支原体存在，则检品为通过该试验。

    试剂

Bisbenzimid：C25H27Cl3N6O·5H2O（Mr．624），4一［5－［5－（4－Methylpiperazin－ 1-yl） benzimidazol— 2— yi］            benzimidazol－2－yl］phenoltrihydrochloride pentahydrate。

Bisbenzimid贮备液：取5mg bisbenzimide溶于水稀释至100ml，保存于暗处。

Bisbenzimis工作溶液：用前即时用 pH7．4磷酸缓冲生理盐水稀释 100μ1 bisbenzimid贮备液至 100ml。

    磷酸盐枸橼酸盐缓冲液， pH5．5：取56．85ml2．84％（m／v）无水磷酸氢二钠溶液与43.15ml2．l％（m／v）枸橼酸溶液混合。

 

 

 

 

 

 

 

生物技术产品质量

生物技术产品／生物制品稳定性试验

（草案FDA，1995，8）

      前言

本文作为ICH制定的“新药半成品和成品指南””（1993年10月27日）的补充件。总体来讲，该指南中所制定的原则适用于生物技术产品／生物制品，然而，因生物技术产品/生物制品确有不同的特性，在预计的储存期间，用来证实生物技术/生物品稳定性的任何一种已确定的试验方案都应考虑这些特性。这些产品的活性成分是由典型的蛋白质和／或多肽组成，保持其分子构型并提高生物活性取决于非共价键和共价键强度。这些产品对周围环境因素如：温度变化，氧、光、离子含量，切应力等等特别敏感，为了确保其生物活性并避免降解，严格的储存条件是必要的。

稳定性评估可能是综合性分析方法学所必须的。对生物学活性的测定，是关键性稳定性研究的一个基本部分。相应的物理化学、生物化学和免疫化学方法对于分子实体的分析和降解制品量的检出，也应是稳定性计划的一部分，无论是制品的纯度还是分子特性都允许利用这些方法学。

首先要关注的是：生物技术产品／生物制品申请者应拿出合适的支持其制品稳定性的数据，并应考虑到能影响制品效力、纯度和质量的诸多外部条件。无论是半成品还是成品，支持一种被要求的储存期的主要数据，应以在长期、实际时间及实际条件下稳定性研究进行的。因此，要使一种制品成功地发展成为商品，那么其相应的长期稳定性方案的产生就成为关键。本文的目的是为那些关注稳定性研究模式的申请者提供指南，这些模式将被用来支持市场应用。不言而喻，在检查与评估过程中，对最初稳定性资料应不断的更新。

附件的范围

在此附件中，已采纳和解释的原则适用于：已充分定性的蛋白质、多肽及其衍生物和由其组成的制品以及从组织、体液、细胞培养物中分离的或以 rDNA生物技术生产的制品。因此，此文件涉及如下制品稳定性资料的产生和提交：细胞因子（干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、促红细胞生成素、血纤维蛋白溶酶原、激活剂、血液血浆因子、生长激素和生长因子、胰岛素、单克隆抗体和由已充分鉴定的蛋白质、多肽制成的疫苗。另外，在以下章节所概括的原则也可适用于其他类制品，如：由有关行政当局评审后的常规疫苗。

此文件不涉及抗生素，变应原浸出物、肝素、维生素及全血。

    命名法

    此附件的基本名词请参照ICH三方协议指南“新药半成品和成品稳定性试验”（1993年10月27日）的词汇表。然而，由于生物技术产品和生物制品的生产者所使用的传统命名法，并非总遵从以上在三方指南中所提到的命名法，所以为方便读者，传统名词则放在括号内加以说明。补充词汇表也含有对生物领域传统名词的解释。

批量的选择

原料药（ drug substance）（半成品物质，bulk material）

半成品原料生产之后，到配成制剂和成为最终成品之前，此半成品原料应被储存，并应提交至少三批能代表产品生产规模的半成品原料生产和储存的稳定性资料。对于要求储存期超过六个月的半成品原料，所提交的资料至少是六个月的；对于储存期少于六个月的半成品原料，其最低限度的稳定性数据应依具体情况而定。向管理机构递交档案的同时，应提交在小规模条件下发酵和纯化的已定性半成品的中试规模批的资料，并保证将最初三批大规模生产的产品稳定性资料，在审批以后列入长期稳定性计划中。

列入稳定性计划中的半成品的质量，既代表用于临床前和临床中研究制品的质量，又代表着生产规模中制品的质量。另外，中试规模的半成品应以一种程序进行生产，并在能代表生产规模的条件下储存。在生产中列入稳定性计划的半成品应储存在能代表生产规模实际状态的容器中。如果容器是用同种原料制成，或者是采用在生产过程中常现被应用的相同类型的容器／封盖（container/closure）系统，那么对于半成品原料药稳定性的监控来说，按比例缩小的容器是可以接受的。

      中间产物

生物技术产品／生物制品在大规模生产中，中间产物的质量控制可能是最终产  品生产的关键。通常，生产者应对中间产物进行鉴定、形成在生产范围内能确保其稳定性的室内数据与规定，在中试规模的数据被批准后，生产者应建立起相应于大规模生产的数据。

药品（drug product）（成品， final container product）

对于生产规模有代表性的最终产品，至少要提供三批稳定性资料，可能的话，涉及稳定性试验的最终产品的批应来源于半成品的不同批量。储存期超过六个月的制品，所提交的稳定性数据至少是六个月的，对于储存期少于六个月的制品，其最低限度的稳定性数据应根据具体情况进行测定。制品失效日期应根据申请者提交的实际数据确定。由于失效日期是根据检测的实际时间／实际温度数据确定的，所以希望最初的稳定性数据能在检测及评估过程中继续进行改进。如果规模生产的制品在效期全过程内，不符合长期稳定性规格或对用于临床前和临床中研究的材料没有代表性，申请者应通过有关当局确定适当的方案。

    样品选择标准

一种制品成批分装按：容量（如：lml、2ml或10ml），单位量（如：10个单位、20个单位或50个单位），或质量（如：lmg、 2mg或5mg），做为样品可以根据基质系统和／或通过分类的选择列入稳定性计划中。

基质系统就是：一种以不同抽样点而测试不同部分样品稳定性研究的统计学设计。只有在提交的文件确能证明测试样品的稳定性可以代表全部样品的稳定性时，此设计才可能被采用。对于同种制品，也应鉴别其样品的不同性，例如：对于涉及相同封盖的不同批次，不同浓度，不同尺寸，以及在某些情况下，不同的容器/封盖系统。对于存在对稳定性有影响差异的样品基质系统是不能应用的，如：不同浓度和不同容器／封盖，因为在储存条件下产品有相同的反应是无法被证实的。

相同浓度和确定容器/盖子系统适用于三种或三种以上的装填物，申请者可选择从最小到最大容器列入稳定性计划，也就是“分类”。体现分类的协议书设计应表现样品中间产物的极限。总之，有必要提供数据证明所收集的极限数据可适当地体现全部样品。

    稳定性指示图

总体看来，生物技术产品/生物制品稳定性特性没有单一的测定和参数来表示。所以，生产者应规范出一个稳定性指示图，对制品的同一性、纯度和效力变化的检测提供保证。

也希望申请者/公司在提出申请的时候，已对稳定性指示图的组成和观察所得资料的方法作了验证。鉴定试验应该包括检测制品的特异性。以下小节并不包括所有内容，只是制品特性的代表，此特性应能典型地对制品稳定性提供证明。

协议书

带有市场认可申请书的档案应包括一份既对原料药又对成品稳定性进行评估的详细协议书，以此来说明其贮存条件和失效期。计划书应包括所有必需的资料，完整的标准、试验间隔期等等，总体而言，就是通过对失效期限的判定来表示生物技术产品／生物制品的稳定性。所使用的统计学方法在三方指南中加以说明。制品生产者要严格忠于协议书。

效力

一种打算要应用的制品，不管其是否有界定和可测定的生物活性有关联，效力试验都应成为稳定性研究的一部分。效力试验应在稳定性协议书所确定适当的差异下进行，并实验结果应以生物活性标准单位来报告。可能的话，无论何时都要与被认可的国家或国际标准相对照。国家或者国际协议不能达到效力单位的地方，实验结果应以一种用适当定性的参考制品制备的内部单位来报告。

有些生物技术产品/生物制品，效力是由活性成分与次要部分或佐剂相结合而决定，从用于结合物或佐剂的载体中分离的活性成分应进行实际时间／实际温度的检查（包括在运输过程中遇到的情况）。对这些制品稳定性评估可能涉及一些困难，因此在某些情况下，检测生物活性和物理化学特性的体外试验不切合实际或提供的结果是不准确的，适当的策略（例如：在结合前检测制品，活性成分从次要部分释放出来，体内检测等等）或适当替代试验的应用都是克服体外试验不足应考虑的。

纯度和分子特性

列入稳定性研究的生物技术产品／生物制品，其降解制品的纯化程度以及个体与总体的最高限度，只要可能的话，就应写到报告中。降解可接受的限度应来源于对临床前和临床研究的半成品和成品的多批次分析。

为了确定原料药和/或成品的物理化学特性，相关的物理化学、生物化学和免疫化学分析方法学的使用要求有一个活性成分的综合特性（如：分子大小、电荷、流水性等等）以及对由于在储存期间通过脱酰胺、氧化作用、磺化氧化作用、凝集反应或裂解所导致的降解变化的准确鉴定。例如可用的方法有：电泳（SDS-PAGE、免疫电泳、 Western blot、等电点），高压液相层析（反相层析法、凝胶过滤、离子交换、亲和力层析等等）和肽定位图。

在长期加速和/或受力的稳定性研究过程中，要对降解制品形成具有预示性的明显质变和量变进行鉴定，在长期稳定性计划中应对潜在的危险和对降解制品定性和定量的需求给予考虑，在观察用于临床前和临床试验材料的时候要提出可接受的限度并证明其合法。

对于不能很好表达特征的物质和不能通过常规分析方法准确测定纯度的制品，申请者应提出变换用其他检测程序。

其他制品的特征

以下制品的特征，虽然与生物技术产品/生物制品不是特别相关，但也应对最终产品进行检测与报告：

制品的外观（溶液/悬液的颜色和不透明性；粉剂的颜色、质地和溶解时间），溶液或溶解后的粉剂，其中可见颗粒或粉剂及冻干制品的冻干块，pH值及温度。

无菌试验或替代办法（如：容器／封盖的完整性试验）应在推荐的有效期的开始和最后进行。

添加剂（稳定剂、防腐剂等）或赋形剂可能在有效期内失效。在进行初步稳定性研究时，如果因这些添加物的反应或失效而对制品的质量有不利影响的话，那么在稳定性计划中就需要对这些项目进行检测。

如果容器／封盖对制品有潜在的不良影响，就应对其作仔细的评估，封盖的形状、小瓶套筒铅封类型也应考虑（见下文）。

储存条件

温度

由于大多数生物技术产品/生物制品成品需要精确的特定储存温度。所以推荐的储存条件可能对真实时间境实温度下的稳定性研究有限制作用。

湿度

生物技术产品/生物制品通常分装于防潮湿的容器中。因此，如果容器（和储存条件）能充分防潮湿，那么各种相应湿度的稳定性试验通常可省略，如果没有使用防潮湿的容器，那么应提供有关的稳定性数据。

    加速和受力试验

正如前文所提到的，失效期一般是依据实际时间／实际温度的数据而定的。然而特别强调的是对半成品和成品失效期的研究应在加速和受力的条件下进行。在加速条件下的研究，可以为确定制品的失效期提供有利的证明数据。为制品今后进一步发展提供稳定性信息资料（例如，对被推荐的象在配制、比例等方面的生产改变），有助于验证稳定性的分析方法，及帮助得到阐明半成品或成品降解的信息资料。在受力条件下的研究，可能对采用意外暴露的条件而不是对制品有害的推荐条件（例如：在运输期间）的决定是有用的，也有助于对特异性试验参数可能成为最好的制品指示剂进行评价。对半成品和成品暴露极限条件的研究，有助于揭示降解的模式；假如如此，根据规定储存条件对这些变化就应进行监控。尽管三方指南对加速和受力研究条件进行叙述，但申请者应该注意那些条件对于生物技术产品/生物制品可能是不适宜的。应该根据具体情况仔细选择。

    光度

申请者应会同有关管理当局，根据具体情况为试验作测定指导。

    容器／封盖

由于配制后的生物技术产品/生物制品与容器／封盖的相互作用，可使制品质量发生改变。对于液体制品；无相互作用的情况不能被排除（密封的安瓶除外），用于稳定性试验的样品应包括经倒置、水平放置（与封盖相接触）和竖置的样品，以确定封盖对制品质量的影响。应提供所有将投放市场的不同容器/封盖制品的数据。

另外，申请者除应提供通常一次性使用小瓶的必需的标准资料外，还应证明乘装多剂量制品的封盖能够经受反复的插入和抽取，以使得制品在容器、包装和/或标签说明书中规定的最大期限内保持其高效力、纯度和质量。此类标签应符合国家／地区的有关要求。

    重溶的冻干制品的稳定性

应证明重溶冻干制品是否符合容器、包装和／或包装内说明书中规定的储存条件下和最大储存期限的稳定性，此类标签应符合国家／地区的有关要求。

    检测频率

由于生物技术产品/生物制品的储存期限可能是几天或几年不等，因此很难起草适合于各类生物技术产品/生物制品的有关稳定性试验期限和检测频率的统一的指南。然而除少数制品例外，现有制品和将来可能的制品储存期限将在半年到五年范围内，所以以下的建议则以此储存期限为基础，并考虑到生物技术产品／生物制品的降解常常受到储存期内不同时间的不同因素影响的事实。

当建议的储存期限为一年或一年以内时，实际的稳定性试验通常应在头三个月内每月进行一次，此后每三个月进行一次。

当建议的制品储存期限为一年以上时，应在储存期第一年每隔三个月进行一次，试验，第二年每六个月一次，其后每年一次。

如在制品的批准或发证前阶段以上试验间隔是合适的，那么在批准或发证后，可得到能充分证明其稳定性的资料时，减少试验是适宜的。当现有的资料证实某一制品的稳定性有问题时，申请者应提交一个支持去除特定试验间隔期的（如九个月的试验）用于批准/发证后、长期研究的方案。

    标准规格

生物技术产品/生物制品可能因储存期大量活性丢失和理化降解而影响其质量，但是国际和国家管理法规中很少就如何区别制品签发及效期终末的标准提出指导意见。目前，对单种或一类生物技术产品／生物制品在推荐的效期内可接受的最大活性丢失量或理化降解限度，尚未提出建议，只是根据具体情况而定。在所建议的储存期限内，各种制品的安全性、纯度和效力应保持在所设定的标准界限内。这些标准的限定应产生于以适宜的统计学方法获得的资料。制品签发和效期终未的不同标准规格，应有充分的资料依据以证明其临床性能未受到影响。应根据三方指南中相应部分的基本原则制定此建议。

    标签

    应对多数生物技术产品/生物制品半成品和成品的储存温度加以明确限定。特别是对于不耐冷冻的半成品与成品，应提出特殊要求。容器、包装和／或包装内说明书中应注明其储存条件和适宜的储存地点，以及避免光照和/或湿度的建议。此类标签应符合国家／地区的有关要求。